黃瓜防病促長(zhǎng)型微生物制劑的篩選與利用

安亞虹 周 珩 李 婧 寧大志 張 鈺 郭世榮

黃瓜防病促長(zhǎng)型微生物制劑的篩選與利用

安亞虹 周 珩 李 婧 寧大志 張 鈺 郭世榮*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部南方蔬菜遺傳改良重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095）

以黃瓜品種津研4號(hào)為試材，采用基質(zhì)栽培，研究了7 種微生物制劑對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)、葉綠素含量及凈光合速率的影響，篩選出具有明顯促長(zhǎng)效果的生物制劑，并測(cè)試了其對(duì)黃瓜枯萎病的防病效果。研究表明，每4 L基質(zhì)中添加創(chuàng)博微生物菌劑10 mL（稀釋600倍液）或“爸愛我”（Bio）生物有機(jī)肥30 g對(duì)黃瓜促長(zhǎng)防病效果較好，定植后植株的抗病能力明顯高于對(duì)照，相對(duì)防效分別為14.5%和27.4%。為促進(jìn)有機(jī)基質(zhì)栽培黃瓜植株生長(zhǎng)、防止枯萎病的發(fā)生，可在4 L有機(jī)育苗基質(zhì)中添加30 g “爸愛我”（Bio）生物有機(jī)肥。

黃瓜；枯萎??；促長(zhǎng)；微生物制劑

黃瓜是大眾喜食的蔬菜作物之一，設(shè)施栽培普遍，但連作重茬及復(fù)種指數(shù)較高，加上生育期多高溫高濕氣候，易發(fā)生連作障礙（侯紅利 等，2008；王濤 等，2010）。黃瓜枯萎病在黃瓜連作生產(chǎn)中為害嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致絕產(chǎn)，已成為黃瓜可持續(xù)生產(chǎn)中的一大障礙（段廣榮 等，2010）。長(zhǎng)期以來，人們?cè)噲D通過多種方式解決連作障礙，如輪作、嫁接、選育抗病品種等，但由于受到土地使用制度、砧木選擇、育種時(shí)間及栽培環(huán)境等因素的影響，這些技術(shù)的應(yīng)用受到一定的限制（王濤 等，2010）。目前，生產(chǎn)上主要還是以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治又受農(nóng)藥品種數(shù)量、農(nóng)藥適宜環(huán)境的限制，并在使用過程中易造成環(huán)境污染。作為病害防治方法之一的生物防治，有時(shí)具有良好的防治效果。近年來，國(guó)內(nèi)外廣泛利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物來抑制病原菌的生存和活動(dòng)，使得這一防治策略發(fā)展迅速（程亮等，2003；侯紅利 等，2008）。

生防菌制品含有大量的有益活菌物質(zhì)及多種天然發(fā)酵活性物質(zhì)，能夠在根區(qū)繁殖形成有利于作物生長(zhǎng)的微生物優(yōu)勢(shì)菌群來調(diào)節(jié)根際營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，協(xié)助作物吸收營(yíng)養(yǎng)，改善和恢復(fù)土壤微生態(tài)平衡（解開治 等，2009；王濤 等，2010）。活菌物質(zhì)形成的菌根增加了植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，改善了植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)了作物的生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)生的激素類物質(zhì)能有效抑制多種真菌、細(xì)菌、病毒等造成的病害，最大限度地減輕土傳病害的發(fā)生（耿廣東 等，2008；于恩晶 等，2010；李建華 等，2011）?？莶菅挎邨U菌是自然界分布非常廣泛的一種生防菌，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一，它可以產(chǎn)生多種對(duì)植物病害有防治作用的抗菌物質(zhì)，包括脂肽類和肽類抗生素，利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)作物病害進(jìn)行預(yù)防和治療已有成功的例子（劉年浪等，2006）。本試驗(yàn)選取7種含有枯草芽孢桿菌的生防菌劑或菌肥，與育苗營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)組合應(yīng)用，探討不同微生物制劑對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)、葉綠素含量及凈光合速率的影響，篩選出具有明顯促長(zhǎng)效果的生物制劑，測(cè)試了其對(duì)黃瓜枯萎病的防病效果，并對(duì)最佳微生物制劑、最佳使用濃度進(jìn)行了研究，以達(dá)到防病促長(zhǎng)的目的。

1 材料與方法

1.1 試材與處理

選用黃瓜（Cucumis sativus L.）品種津研4號(hào)為試驗(yàn)材料，試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地的現(xiàn)代化溫室中進(jìn)行，于2011年9月至2012年5月重復(fù)

進(jìn)行2次。種子于28～30℃培養(yǎng)箱中催芽，采用50孔穴盤育苗，基質(zhì)配方為等體積的草炭和醋糟，容重為0.29 g·cm-3，總孔隙度為73.2%，EC值3.2 mS·cm-1，pH值6.37。

試驗(yàn)所用的3種生防菌肥（生物有機(jī)肥）為：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研制的“爸愛我”（Bio）生物有機(jī)肥（簡(jiǎn)稱Ba），蘇柯漢生物工程有限公司提供的蘇柯漢菌肥（S），青島百事達(dá)生物肥料有限公司提供的三帝生物有機(jī)肥（D）；4種生防菌劑為：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院與北京啟高生物科技有限公司聯(lián)合開發(fā)的菌劑B006（B）和混合菌劑E（E），上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司開發(fā)的創(chuàng)博微生物菌劑（Y），湖北啟明生物工程有限公司提供的啟明微生物菌劑（Q）。根據(jù)用法、用量各設(shè)5個(gè)濃度梯度混入育苗基質(zhì)中（每穴盤裝入4 L基質(zhì)，加入不同用量微生物制劑）進(jìn)行穴盤育苗，各種制劑用量及簡(jiǎn)稱見表1，并設(shè)置空白對(duì)照CK（即不添加任何微生物制劑）。播種后第28天時(shí)取樣，測(cè)定植株生長(zhǎng)指標(biāo)和光合作用參數(shù)。

從供試的7種微生物制劑中篩選出2個(gè)促長(zhǎng)效果較好的微生物制劑處理，將其穴盤苗定植到栽培桶中（容積14 L，裝10 L基質(zhì)），定植時(shí)補(bǔ)充1次菌肥或菌劑，按育苗試驗(yàn)中的最大劑量進(jìn)行添加，同時(shí)定植空白對(duì)照，各50株。定植后第7天用灌根法接種黃瓜枯萎病病菌，孢子濃度為1×107cfu·mL-1，用量100 mL，14 d后重復(fù)接菌1次。常規(guī)管理，觀察記錄植株發(fā)病情況，記錄發(fā)病日期，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

表1 微生物制劑及其用量

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 基質(zhì)的理化性狀 參照郭世榮（2003）的方法測(cè)定基質(zhì)的容重、孔隙度；稱風(fēng)干基質(zhì)10 g浸泡在50 mL去離子水中，經(jīng)3 h后提取濾液，測(cè)定pH值、電導(dǎo)率（EC）。

1.2.2 幼苗生長(zhǎng)量 隨機(jī)選10株28日齡黃瓜幼苗，用直尺測(cè)量幼苗的株高（根基到生長(zhǎng)點(diǎn)），游標(biāo)卡尺測(cè)量莖粗（子葉下1 cm處）；測(cè)定地上部和地下部鮮質(zhì)量，105 ℃殺青15 min，75 ℃烘干至恒重, 測(cè)定地上部和地下部干質(zhì)量；用臺(tái)式掃描儀（EPSON EXPERSSIN 1680）將新鮮的黃瓜幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)下第2片功能葉和根系圖像掃描入電腦，再用圖像分析軟件Win RHIZO（加拿大Regent Instruments公司）分析葉面積、總根體積等。

1.2.3 葉綠素含量和凈光合速率 采用乙醇∶丙酮∶水為4.5 V∶4.5 V∶1 V浸提法測(cè)定葉綠素含量；用便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)（Li-6400型，美國(guó)）于晴天9：00～11：00 進(jìn)行光合參數(shù)的測(cè)定，測(cè)定葉位為生長(zhǎng)點(diǎn)下第2片葉片，測(cè)定時(shí)葉室溫度控制在（25±1）℃，光照強(qiáng)度控制在800 μmol·m-2·s-1，參比室CO2濃度為（380±10） μmol·L-1，相對(duì)濕度為60%～70%。

1.2.4 病情指數(shù) 生防菌肥與生防菌劑抗病性對(duì)比試驗(yàn)中，接種黃瓜枯萎病菌后調(diào)查發(fā)病情況，根據(jù)丁建成等（2008）制定的黃瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算病情指數(shù)及防效。

黃瓜枯萎病發(fā)病嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，根、莖、葉生長(zhǎng)正常；Ⅰ級(jí)，1/4以下根、莖變黃，植株稍有矮化；Ⅱ級(jí)，1/4～1/2根、莖變黃，下部葉脈褪色；Ⅲ級(jí)，1/2～3/4根、莖變黃，莖基縱裂；Ⅳ級(jí)，3/4以上根、莖變黃或直接枯萎死亡。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)病情嚴(yán)重度代表值） / （最高級(jí)代表值×調(diào)查總株數(shù)）×100

防效=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)） / 對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物制劑對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

如表2所示，育苗基質(zhì)中添加不同濃度的生防菌劑Y、Q、E，均能不同程度地增加黃瓜幼苗的株高、莖粗、地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量，其中Y500、Y600、E14處理效果與對(duì)照差異顯著；而生防菌劑B各濃度對(duì)黃瓜幼苗株高、單株地上部干質(zhì)量和地下部的促進(jìn)作用不明顯。綜合看，在加入4種生防菌劑后，與對(duì)照相比黃瓜植株地上部與地下部生長(zhǎng)均有不同程度的提高，而促長(zhǎng)效果最好的處理為Y600。

表2 生防菌劑對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

如表3所示，育苗基質(zhì)中添加生防菌肥Ba能不同程度地增加黃瓜幼苗的單株地上部干鮮質(zhì)量、葉面積，而添加不同濃度的生防菌肥S對(duì)黃瓜幼苗地上部生長(zhǎng)不利；生防菌肥D、S、Ba（D20、D50除外）能不同程度地提高黃瓜幼苗地下部生長(zhǎng)指標(biāo)，其中生防菌肥Ba各濃度處理效果都較明顯。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，Ba30對(duì)黃瓜幼苗促生長(zhǎng)效果顯著。

2.2 微生物制劑對(duì)黃瓜幼苗葉片葉綠素含量和凈光合速率的影響

如表4所示，與對(duì)照相比，育苗基質(zhì)中添加不同濃度的生防菌劑Y、Q、E、B（Q6、B6、B18除外）均能不同程度地增加黃瓜幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素 b和總?cè)~綠素含量，其中生防菌劑Y的增加效果明顯， Y600處理效果顯著。不同生防菌劑處理對(duì)黃瓜幼苗葉片凈光合速率的影響存在較大差異。與對(duì)照相比，生防菌劑（Q10、B2除外）處理后凈光合速率均明顯提高，其中Y600、E18處理效果最明顯，且兩者間差異不顯著。

如表5所示，育苗基質(zhì)中添加不同濃度的生防菌肥D、Ba能不同程度地增加黃瓜葉片的葉綠素 a、葉綠素 b、總?cè)~綠素含量，其中Ba30處理效果最明顯。不同濃度的生防菌肥S處理對(duì)黃瓜葉片葉綠素 a、葉綠素 b、總?cè)~綠素含量增加不明顯。與對(duì)照相比，不同生防菌肥處理可不同程度地提高幼苗葉片的凈光合速率，其中Ba30處理效果最明顯。

2.3 微生物制劑對(duì)黃瓜枯萎病的影響

從供試的7種微生物制劑中篩選出2個(gè)促長(zhǎng)效果較好的微生物制劑處理Y600和Ba30，對(duì)其防治黃瓜枯萎病的效果進(jìn)行了研究。如表6所示，與對(duì)照相比，Y600及Ba30的施用使黃瓜枯萎病病情指數(shù)明顯降低，相對(duì)防效分別為14.5%和27.4%。Ba30的相對(duì)防效高于Y600，說明經(jīng)Ba30處理的黃瓜植株比Y600處理的植株對(duì)枯萎病的抵抗能力強(qiáng)。

表3 生防菌肥對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

表4 生防菌劑對(duì)黃瓜幼苗葉片葉綠素含量和凈光合速率的影響

表5 生防菌肥對(duì)黃瓜幼苗葉片葉綠素含量和凈光合速率的影響

表6 微生物制劑對(duì)黃瓜枯萎病的影響

3 結(jié)論與討論

連作促使根際土壤微生物區(qū)域致病真菌數(shù)量增加，產(chǎn)生毒害物質(zhì)致使有益真菌減少，細(xì)菌密度下

降，放線菌數(shù)量也隨之降低，從而使黃瓜根系病害加重，影響了根系發(fā)育，不利于植株生長(zhǎng)（楊建霞等，2005）。李文英等（2012）研究表明含枯草芽孢桿菌的微生物制劑能提高土壤中可吸收元素的含量，將無效養(yǎng)分轉(zhuǎn)變?yōu)橛行螒B(tài)供植物吸收，如N、P素的增加有利于植株光合作用與形態(tài)器官建成，K、Ca的增加有利于提高植株的抗逆能力，Mg的增加有利于葉綠素的合成，增強(qiáng)植株光合作用。本試驗(yàn)中，與對(duì)照相比，微生物制劑對(duì)黃瓜幼苗具有明顯的促生長(zhǎng)效應(yīng)，主要表現(xiàn)為株高、莖粗、葉面積、單株總根體積、根系生物量及地上部生物量的增加。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素，主要包括葉綠素 a和葉綠素 b，參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，其含量是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)（Mao et al.，2007）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，適宜濃度的微生物制劑處理的植株葉片葉綠素 a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量及凈光合速率明顯提高，說明微生物制劑對(duì)葉綠素起到一定的保護(hù)作用，有利于植株光合能力的保持。

枯草芽孢桿菌為細(xì)菌性抑菌劑生防菌，能在植物表面迅速形成一層高密度保護(hù)膜，通過競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)、繁殖占據(jù)生存空間，抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，從而保護(hù)農(nóng)作物免受病原菌為害（回云靜 等，2011）。瓜類蔬菜枯萎病菌從苗期開始侵入，在寄主維管束中繁殖，坐果期地上部開始顯示病害癥狀。在苗期通過生防菌建立屏障阻止病原菌對(duì)根系的侵入，對(duì)控制后期病害的發(fā)生意義重大（莊敬華等，2005）。本試驗(yàn)在育苗基質(zhì)及苗期栽培基質(zhì)中添加微生物制劑，這些拮抗功能菌隨著作物根系向外生長(zhǎng)始終聚集和繁殖在新生根系表面及其附近，筑成了有益微生物的“微生物墻”，抵抗枯萎病菌的侵襲，明顯降低了枯萎病的病情指數(shù)。

綜上所述，在有機(jī)育苗基質(zhì)中添加“爸愛我”（Bio）生物有機(jī)肥，既能顯著促進(jìn)黃瓜幼苗植株的生長(zhǎng)，又能提高定植后植株對(duì)枯萎病的抗性，以每4 L育苗基質(zhì)（配方為等體積草炭和醋糟）中添加30 g“爸愛我”（Bio）生物有機(jī)肥為最佳。

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Screening and Utilization of Microbiological Preparation to Promote Cucumber Growth and Resistance

AN Ya-hong，ZHOU Heng，LI Jing，NING Da-zhi，ZHANG Yu，GUO Shi-rong*

（CollegeofHorticulture，KeyLaboratoryofSouthernVegetableCropGeneticImprovement，MinistryofAgriculture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，Jiangsu，China）

A matrix cultivation was conducted to study the effects of 7 different species and concentrations of microbiological preparation on biomass，chlorophyll content and net photosynthetic rate of‘Jinyan No.4’cucumber （Cucumis sativus L．）．Biomass with remarkable growth promoting effect was screened out and their resistance to cucumber Fusarium wilt was tested．The result indicated that treatments with Ba （bio-organic fertilizer） and Y（Chuang Bo microbial agents） performed better，and the best processing concentration for Chuang Bo is adding 10 mL diluted 600 times，and for Ba is adding 30 g per nursery substrate of one plug（4 L）．The plant resistance with Chuang Bo and Ba is higher than that of the control．The relative anti-effect is 14.5% and 27.4%，respectively．Under the condition of protected cultivation，for promoting cucumber growth and resistance to Fusarium wilt，we would suggest to use bio-organic fertilizer and add 30 g Bio per nursery substrate of one plug（4 L）．

Cucumber；Fusarium wilt；Promote the growth；Microbiological preparation

安亞虹，女，碩士研究生，主要從事蔬菜學(xué)研究，E-mail：2013104049 @njau.edu.cn

*通訊作者（Corresponding author）：郭世榮，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事設(shè)施園藝與無土栽培研究，E-mail：srguo@njau.edu.cn

2013-11-14；接受日期：2013-12-23

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（1114CY02），江蘇省農(nóng)業(yè)三項(xiàng)工程項(xiàng)目〔SXGC（2013）331〕，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（CARS-25-C-03）