種子芥酸和硫苷含量對甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

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（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長沙410128）

種子芥酸和硫苷含量對甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

魏解冰1，肖文娟2，劉春林1，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長沙410128）

選取低硫苷低芥酸含量的甘藍型油菜品種“湘油15號”和“Westar”，高硫苷高芥酸含量的甘藍型油菜品系“GX-272”和“GX29”，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以pFGC5941為目標載體，分別對其進行遺傳轉(zhuǎn)化。以磷化麥黃酮（PPT）作為篩選劑，分別對4個油菜品種（系）的子葉柄分化率和轉(zhuǎn)化率進行統(tǒng)計。結(jié)果表明，雙低油菜“湘油15號”、“Westar”的子葉柄分化率高于高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”；而高硫苷高芥酸油菜“GX-272”和“GX29”的轉(zhuǎn)化率則高于雙低油菜“湘油15號”、“Westar”。初步認為種子中硫苷和芥酸含量對甘藍型油菜子葉柄遺傳轉(zhuǎn)化的分化率和轉(zhuǎn)化率有一定影響。

甘藍型油菜；硫苷；芥酸；遺傳轉(zhuǎn)化

油菜是我國最重要的油料作物之一，菜籽油是目前全球僅次于大豆油和棕櫚油的第三大植物油。而甘藍型油菜是3種油用油菜中產(chǎn)油量最高的品種。針對甘藍型油菜進行的基因工程研究目前已廣泛開展。然而，當(dāng)前以甘藍型油菜作為受體的遺傳轉(zhuǎn)化工作的轉(zhuǎn)化效率較低，一直無法達到商業(yè)化的標準和目的，嚴重制約了轉(zhuǎn)基因油菜的發(fā)展。為了解決這一問題，育種工作者們進行了多方面的實驗。王艷等［1］發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜子葉柄在誘導(dǎo)分化前經(jīng)過含有2，4-D的MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移至含有適量6-BA、NAA和AgNO3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可較大程度地提高植株再生頻率。王景雪等［2］發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸轉(zhuǎn)化中，在農(nóng)桿菌侵染前進行外植體預(yù)培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的浸染濃度為OD600＝0.2～0.4，共培養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.2時，轉(zhuǎn)化效率較高。劉曉慶等［3］發(fā)現(xiàn)，7 d苗齡的甘藍型油菜下胚軸再生頻率為35.83%，經(jīng)3 d預(yù)培養(yǎng)處理的甘藍型油菜下胚軸再生頻率可提高至57.78%。這些實驗證明，甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率還有進一步提高的空間。

盡管前人在甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的具體方法如共培時間、苗齡、激素含量等方面做了許多研究，也取得了大量成果，但甘藍型油菜種子自身代謝產(chǎn)物含量對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響研究卻未見報道。本實驗室在之前的研究中注意到，種子芥酸和硫苷含量似乎對油菜分化和轉(zhuǎn)化率有影響，但未進行系統(tǒng)研究。本研究以此現(xiàn)象為基礎(chǔ)，選取“湘油15號”和“Westar”兩種基因型材料作為雙低甘藍型油菜的代表，選取“GX-272”和“GX-29”兩種基因型材料作為“雙高”甘藍型油菜的代表，以pFGC5941載體上的bar基因作為目標基因，子葉柄作為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化，并分別對分化率和轉(zhuǎn)化率進行統(tǒng)計，以探究甘藍型油菜種子內(nèi)自身代謝產(chǎn)物硫苷和芥酸對甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

甘藍型油菜品種（品系）湘油15號（芥酸含量0.21%，硫苷含量38.5μmol／g）、Westar（芥酸含量0.11%，硫苷含量33.1μmol／g）、GX-272（芥酸含量30.78%，硫苷含量59.62μmol／g）和GX-29（芥酸含量19.96%，硫苷含量98.79μmol／g），由植物代謝調(diào)控與代謝工程實驗室提供。

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株LBA4404為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物代謝調(diào)控研究組保存菌株，載體pFGC5941由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物代謝調(diào)控研究組提供。

1.1.3 分子生物學(xué)試劑

質(zhì)粒DNA小量純化Kit購自O(shè)MEGA公司；DNA Marker購自北京天根；CTAB、Tris base、EDTA均購自歐邁生物；瓊脂糖為西班牙產(chǎn)；酵母提取物、蛋白胨購自O(shè)XOID.LTD；抗生素購自北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心；引物訂購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計

實驗共轉(zhuǎn)化4個品種（系）的甘藍型油菜。每個品種（系）轉(zhuǎn)化4個批次；每批次轉(zhuǎn)化子葉柄外植體約300個，每個品種（品系）共轉(zhuǎn)化約1 200個子葉柄外植體。

1.2.2 外植體的準備

ADRB2、GLCCI1、FCER2基因檢測在2例難治性哮喘患兒個體化用藥中的實踐 ………………………… 任丹陽等（5）：659

選取飽滿的甘藍型油菜種子，經(jīng)75%酒精浸泡30 s，0.1%HgCl2消毒20 min后均勻的鋪在1／2 MS培養(yǎng)基上，暗室培養(yǎng)5 d后取出，光照5 h使子葉變綠。沿生長點以上切下備用。

1.2.3 轉(zhuǎn)化工作液的準備

取保存的帶有pFGC5941的LBA4404于含Kan、Str和Rif 3種抗生素的YEB固體培養(yǎng)基上平板劃線培養(yǎng)約48 h；挑取單菌落接種于已加入Kan、Str和Rif 3種抗生素的10 mL YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，250 rpm，振蕩培養(yǎng)36～40 h后吸取約5 mL左右菌液于50 m L YEB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)至OD600達到1.0；將菌液倒入50 mL離心管中，6 000 rpm，10 min，棄上清；加入約20 mL BM液、9μL的β -巰基乙醇和18μL的乙酰丁香酮后，輕微震蕩使其混勻后倒入已滅菌的平皿中備用。

1.2.4 子葉柄的浸染轉(zhuǎn)化

將外植體浸泡于已準備好的轉(zhuǎn)化工作液中靜置8 min，取出充分瀝干后鋪于共培培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)約40 h。

1.2.5 外植體與抗性苗的培養(yǎng)

將22℃暗培養(yǎng)約40 h后的外植體轉(zhuǎn)入含0.3%的磷化麥黃酮（PPT）和500 mg／m L頭孢霉素的MB篩選培養(yǎng)基［4］上光照培養(yǎng)，每10 d繼代1次。待子葉柄分化出不定苗后將不定苗切下，轉(zhuǎn)入含0.2%PPT的1／2MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)。

1.2.6 煉苗與轉(zhuǎn)化子篩選

待不定苗生根后即轉(zhuǎn)入盛有蛭石的小缽中煉苗培養(yǎng)。待幼苗長出新葉后，取少量葉片提取DNA，利用以下引物進行PCR檢測：

Bar gene-FP：5′-ATGAGCCCAGAACGACGCC-3′

Bar gene-RP：5′-TCAGATTTCGGTCACGGGCA-3′

2×Tag MasterMix聚合酶PCR擴增的反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s；68℃退火15 s；72℃延伸40 s；72℃延伸7 min；16℃保存。擴增35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測為陽性的植株即為轉(zhuǎn)化子。

待轉(zhuǎn)化子植株生長至現(xiàn)蕾期，取少量莖生葉提取DNA，利用相同引物、同樣的反應(yīng)體系再檢測一次，檢測為陽性的植株即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。

2 結(jié)果與分析

2.1 子葉柄分化率

待外植體所形成的愈傷組織再分化成為幼苗時，分別統(tǒng)計4個甘藍型油菜的外植體（子葉柄）數(shù)量和由外植體分化產(chǎn)生的幼苗數(shù)量，并計算每種油菜的分化率。雙低油菜“湘油15號”和“Westar”的分化率均在10%以上，而“GX-29”和“GX-272”的分化率分別只有3.23%和2.54%（表1）。這個結(jié)果表明，雙低油菜比雙高油菜更容易分化，使用雙低油菜更容易分化出抗性苗。

表1 4個油菜品種（系）的子葉柄分化率

2.2 子葉柄轉(zhuǎn)化率

圖1 抗性苗PCR檢測結(jié)果

利用上述的Bar gene-FP／RP引物，在幼苗生長初期先取少量新葉提取DNA，進行PCR檢測（圖1）。待幼苗生長至現(xiàn)蕾期，再取少量莖生葉提取DNA，進行PCR擴增后，即可檢測出穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化子（圖2）。分別統(tǒng)計4個甘藍型油菜品種（系）分化幼苗中轉(zhuǎn)化子的數(shù)量和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，并計算每種油菜的轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化率，結(jié)果于表2。雙低油菜的轉(zhuǎn)化率與穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化率分別只有0.216%和0.041%；而2個雙高油菜的轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化率則達到了0.454%和0.191%。很明顯，“GX-272”和“GX-29”首次檢測的轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化率都遠高于雙低甘藍型油菜；特別是在穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化率上，“GX-272”和“GX-29”平均高出雙低甘藍型油菜4倍有余。

圖2 莖生葉PCR檢測結(jié)果

表2 4個油菜品種（系）的子葉柄轉(zhuǎn)化率

3 討論

甘藍型油菜是由蕓薹與甘藍通過自然種間雜交后加倍進化而來的一種異源四倍體，是我國長江中下游地區(qū)最重要的植物油來源之一。多年來，分子育種工作者一直探尋提高甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化率的途徑，但多數(shù)都是以改變?nèi)绻才鄷r間、共培培養(yǎng)基pH值、激素含量等外部實驗條件作為基礎(chǔ)進行研究，極少探究甘藍型油菜種子自身可能對遺傳轉(zhuǎn)化工作產(chǎn)生的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，不僅外界條件可以對分化率和轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生影響，作為種子自身的代謝產(chǎn)物，硫苷和芥酸對分化率和轉(zhuǎn)化率也能產(chǎn)生十分明顯的影響。如“GX-272”和“GX-29”的轉(zhuǎn)化率就高于雙低甘藍型油菜數(shù)倍；而雙低甘藍型油菜的分化率又遠高于“GX-272”和“GX-29”。這個結(jié)果有力的證明了種子自身的代謝產(chǎn)物對甘藍型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化也起著至關(guān)重要的作用。

在甘藍型油菜遺傳轉(zhuǎn)化工作中，另一個十分重要的問題就是轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性。研究中發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)化子成苗初期的檢測中，能夠檢測出大量的轉(zhuǎn)基因植株，在“GX-272”和“GX-29”中可達到近0.5%；而隨著早期檢測到的轉(zhuǎn)化子的生長和發(fā)育，有的轉(zhuǎn)化子后來生長出的葉片中就檢測不到目標基因的存在，因此很難得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株。這可能和轉(zhuǎn)化子頂端分生組織的嵌合狀態(tài)有關(guān)：在轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)到土中生長后，由于沒有除草劑的選擇壓力，生長點的非轉(zhuǎn)基因細胞可能會因為生長較快而將轉(zhuǎn)基因細胞替換掉，導(dǎo)致后期生長點中完全由非轉(zhuǎn)基因細胞組成。根據(jù)目前已完成的實驗結(jié)果，如果能夠在某一株轉(zhuǎn)基因植株的莖生葉中檢測出陽性條帶，那么這一株轉(zhuǎn)基因植株的T1代也能夠檢測出轉(zhuǎn)基因植株，而如果只能在幼苗初期檢測到陽性條帶的轉(zhuǎn)化子，T1代不一定能檢測出轉(zhuǎn)基因植株。所以，筆者建議在甘藍型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化工作過程中，以莖生葉的PCR檢測結(jié)果來判斷是否為可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株較為可靠。

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Effects of Erucic Acid and Glucosinolate Content in Seeds on Genetic Transformation in Brassica napus L.

WEIJie-bing1，XIAO Wen-juan2，LIU Chun-lin1，2*

（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

In this study，the lower glucosinolate and lower erucic acid content varieties of Brassica napus L.Xiangyou 15 and Westar，higher glucosinolate and higher erucic acid content strainsof Brassica napus GX-272 and GX29 were selected as the experimentalmaterials.The cotyledons petioles from these four cultivarswere transformed with bar gene from vector of pFGC5941 by agrobacterium-mediated method.According to the number of PPT-resistent plantlets and PCR tests，cotyledon petiole differentiation rate and transformation rate of fourmaterialswere counted respectively.The results showed that cotyledon petiole differentiation rate of Xiangyou 15 and Westarwashigher than that of GX-272 and GX29，while the transformation rate was contrary.In this study，glucosinolate and erucic acid content in rapeseed seed affected on cotyledon petiole differentiation rate and transformation rate was preliminarily confirmed.

Brassica napus L.；Glucosinolate；Erucic acid；Genetic transformation

S565.403.2；Q785

A

1001-5280（2014）03-0242-04 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.03

2014 02 10

魏解冰（1988-），男，陜西咸陽人，碩士研究生，Email：baby_usher＠126.com。*通信作者，劉春林，博士，教授，Email：liucl＠hunau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目（31071455）。