吐魯番黑羊MC1R基因序列分析研究

於建國(guó)，陳 童，劉明軍

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊830000；2.新疆畜牧科學(xué)院綿羊研究中心，烏魯木齊830000）

吐魯番黑羊MC1R基因序列分析研究

於建國(guó)1，陳 童1，劉明軍2

（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊830000；2.新疆畜牧科學(xué)院綿羊研究中心，烏魯木齊830000）

為研究黑皮質(zhì)素受體1（MC1R）基因?qū)ν卖敺谏窖蛎挠绊?，試?yàn)采用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)，對(duì)吐魯番黑羊MC1R基因編碼區(qū)核苷酸序列及其與毛色的相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：MC1R基因編碼區(qū)核苷酸序列954 bp，編碼317個(gè)氨基酸，編碼區(qū)存在2個(gè)錯(cuò)義突變（c.218 T>A，p.73 Met>Lys；c.361 G>A，p.121 Asp>Asn）和3個(gè)同義突變（c.429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu；c.735 C>T,p.245 Ile>Ile）。SNPs分析表明,單倍型AATGT數(shù)量占62%。初步認(rèn)為MC1R基因可以作為吐魯番黑羊黑色被毛調(diào)控的候選基因。

吐魯番黑羊；MC1R；SNPs；候選基因

吐魯番黑羊也稱托克遜大尾黑羊，是由當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民通過引進(jìn)巴音布魯克羊與哈薩克羊、卡拉庫爾羊進(jìn)行雜交，長(zhǎng)期選育而培育出的肉用型地方品種。托克遜縣為其主產(chǎn)區(qū)，目前存欄20余萬只，占吐魯番黑羊的90%。周歲種公羊體重44.06kg，成年種公羊體重46.38kg，周歲羊與成年公羊體重相差小。吐魯番黑羊背腰平直，十字部高于耆甲部，頭稍長(zhǎng)，鼻梁微隆起，耳下垂，少數(shù)有不發(fā)達(dá)的角。四肢粗壯，尾肥大，被毛黑色。具有生長(zhǎng)迅速、四肢粗壯、早熟、肉味鮮美等特點(diǎn)。其遺傳特征基本穩(wěn)定，深受當(dāng)?shù)厝罕姷南矏郏?］。

哺乳動(dòng)物的毛色類型很多，已有的研究結(jié)果表明，真黑色素和褐黑色素兩種基本黑色素的合成受E（extension）和A（agouti）基因座位控制。E座位編碼的黑素皮質(zhì)素受體1（MC1R）是G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor）家族中最小的受體，只有一個(gè)編碼區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，主要表達(dá)于動(dòng)物的黑色素細(xì)胞。它與a-促黑色素細(xì)胞激素（a-MSH）作用，對(duì)酪氨酸酶進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控黑色素的形成。黑素皮質(zhì)素受體1（melanocortin 1 receptor，MC1R）基因研究起步較早，但在綿羊上開展的研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)在綿羊毛色方面開展MC1R基因的相關(guān)研究報(bào)道也不多［2-7］。本研究以吐魯番黑羊?yàn)檠芯繉?duì)象，分析黑素皮質(zhì)素受體1基因與吐魯番黑羊毛色性狀的相關(guān)性，為更好地開發(fā)利用吐魯番黑羊這一特殊的毛色綿羊遺傳資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及DNA的提取

在托克遜縣吐魯番黑羊原產(chǎn)地用真空采血管采集純種吐魯番黑羊血液樣品60份，每個(gè)樣品采集2 mL，肝素鈉抗凝，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。采用全血DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增

MC1R基因擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中收錄的綿羊序列Y13965，用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物序列為F：GAGAGCAAGCACCCTTTCCT，R：GAGAGTCCTGTGATTCCCCT，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積25μL，其中：Buffer3μL，dDNTP2μL，上下游引物各1 μL，Taq酶1 U，DNA模板1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足到25 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：94℃，3 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃45 s（35個(gè)循環(huán)），72℃10 min，4℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，選擇目的條帶清晰的PCR樣品送博邁德生物公司進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Chromas、Dnaman等軟件進(jìn)行序列拼接、同源性分析以及進(jìn)化樹的建立。

2 結(jié)果與分析

2.1 MC1R基因序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)吐魯番黑羊MC1R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果表明MC1R基因擴(kuò)增產(chǎn)物在1000bp近上方有一條特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相同。見圖1。

圖1 MClR基因序列PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 MC1R基因核苷酸序列

吐魯番黑羊MC1R基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序獲得1 124 bp核苷酸序列，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)954 bp，編碼317個(gè)氨基酸。在編碼區(qū)存在2個(gè)錯(cuò)義突變（c.218 T>A，p.73 Met>Lys；c.361 G>A，p.121 Asp>Asn)和3個(gè)同義突變（c.429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu；c.735 C>T，p.245 Ile>Ile）。見圖2。

圖2 吐魯番黑羊MClR基因單堿基突變位點(diǎn)

2.3 吐魯番黑羊MC1R基因SNPs

測(cè)序結(jié)果顯示，吐魯番黑羊毛色基因MC1R在編碼區(qū)核苷酸存在218 T>A，361 G>A,429 C>T，600 T>G，735 C>T顛換與轉(zhuǎn)換。由表1可知，吐魯番黑羊MC1R基因存在3種單倍型，其中TGCTC型有5只，占8%；TGTGT型有18只，占30%；AATGT型有37只，占62%。

表1 吐魯番黑羊MClR基因單倍型頻率

3 討論

哺乳動(dòng)物的MC1R基因與皮膚色素沉積、被毛顏色密切相關(guān)，該基因主要在毛囊和皮膚黑素細(xì)胞中表達(dá)，MC1R基因通過控制真黑色素?cái)?shù)量來決定動(dòng)物的毛色。當(dāng)MC1R受到ɑ-促黑色素細(xì)胞激素（a-MSH）的刺激時(shí)就會(huì)通過激活酪氨酸酶產(chǎn)生真黑色素,使動(dòng)物毛色表現(xiàn)為黑色。在MC1R功能喪失或MC1R受到與其拮抗的Agouti蛋白抑制時(shí)，酪氨酸酶不能被激活而保持較低活性，造成真黑色素被稀釋，出現(xiàn)棕色或紅色等較淺的毛色性狀。綿羊的MC1R基因位于14號(hào)染色體，有單一外

顯子基因，相比ASIP等其他毛色基因研究的較多。MC1R基因主要有3個(gè)等位基因（E+、ED和e）在編碼區(qū)發(fā)生堿基突變導(dǎo)致被毛顏色發(fā)生變化。本研究發(fā)現(xiàn)，218 bp（T>A）和361 bp（G>A）兩處堿基突變導(dǎo)致M73K和D121N氨基酸變化，這兩處突變?cè)诤谏览?、卡拉庫爾羊等綿羊品種中也有發(fā)現(xiàn)，M73K和D121N單獨(dú)或共同作用于綿羊黑色被毛性狀，即等位基因ED引起綿羊被毛出現(xiàn)黑色性狀。李洪濤等［8］的研究發(fā)現(xiàn)，MC1R基因P.M73K位點(diǎn)變化與哈薩克羊被毛的顏色變化相關(guān)，MC1R基因是控制哈薩克綿羊被毛顏色的主效基因。

本研究結(jié)果顯示：MC1R基因在編碼區(qū)核苷酸存在218 T>A，361 G>A，429 C>T，600 T>G，735 C>T顛換與轉(zhuǎn)換，其中218 bp（T>A）和361 bp（G>A）2處發(fā)生顛換、轉(zhuǎn)換數(shù)量最多，AATGT單倍型比例占62%。由218bp（T>A）和361 bp（G>A）2處位點(diǎn)突變引起氨基酸73（Met>Lys）和121（Asp>Asn）發(fā)生錯(cuò)義突變，此結(jié)果與李洪濤等［8］研究綿羊毛色基因MC1R在黑色被毛基因調(diào)控的機(jī)理相吻合。MC1R基因核苷酸序列中單倍型TGCTC、TGTGT、AATGT分別占8%、30%、62%，與Guang-LiYang等［2］在研究岷縣黑羊的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

MC1R基因編碼區(qū)核苷酸序列長(zhǎng)954 bp，編碼317個(gè)氨基酸，編碼區(qū)存在2個(gè)錯(cuò)義突變（c.218 T>A，p.73 Met>Lys.c.361 G>A，p.121 Asp>Asn)和3個(gè)同義突變（c. 429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu.c.735 C>T，p.245 Ile>Ile）。SNPs分析顯示，單倍型AATGT數(shù)量占62%。初步認(rèn)為MC1R基因可以作為吐魯番黑羊黑色被毛調(diào)控的候選基因。

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Analysis on MC1R Sequences of Turpan Black Sheep

Yu Jian-guo1，Chen Tong1，Liu Ming-jun2
（1.XinjiangAcademyofAnimal Sciences，Urumqi 830000，China；2.XinjiangAcademyofBiotechnological Center，Urumqi 830000，China）

Tostudythe effects ofmelanocortin receptor 1（MC1R）on the wool colour in Turpan black sheep，the codingregion nucleotide sequence ofMC1R gene ofTurpan black sheep and its correlation with the wool colour were studied byusingPCR amplification and sequencingtechniques.The results showed that the codingregion nucleotide sequence ofMC1R gene was 954 bp,encoding 317 amino acids,there were two missense mutations（c.218 T>A，p.73 Met>Lys；c.361 G>A，p.121 Asp>Asn）and three silent mutations（c.429 C>T，p.143 Tyr>Tyr；c.600 T>G，p.200 Leu>Leu；c.735 C>T，p.245 Ile>Ile）in the coding region.SNPs haplotype of AATGT accounted for 62%.It is suggested that the MC1R gene can be used as the candidate gene in regulating the black wool ofTurpan black sheep.

Turpan black sheep；MC1R；SNPs；candidate gene

S826.2

A

2095-3887（2014）04-0016-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.04.004

2014-04-26

新疆自治區(qū)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)

於建國(guó)（1977-），男，助理研究員，碩士。

劉明軍（1964-），男，研究員，博士。研究方向：分子生物學(xué)。