不同檢測方法分析紫甘薯紅色素的抗氧化能力

孫曉俠，王改玲，吳珊珊，錢時權(quán)，馬 龍，許 暉（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

不同檢測方法分析紫甘薯紅色素的抗氧化能力

孫曉俠，王改玲，吳珊珊，錢時權(quán)，馬 龍，許 暉
（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

采用比色法（分光光度法）、化學(xué)發(fā)光法、熒光法分析了紫甘薯紅色素對體外活性氧（O2-·和·OH）的清除作用和對體外脂質(zhì)體過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）生成的抑制作用。結(jié)果表明：紫甘薯紅色素對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的O2-·具有一定的清除作用，但低于對照抗壞血酸（VC），采用化學(xué)發(fā)光法測定時，這種清除效果強(qiáng)于采用比色法；色素對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有清除作用，采用化學(xué)發(fā)光法測定時，這種清除效果最好（高于VC），熒光法次之（稍高于VC），比色法最差（高濃度時顯著低于VC）；對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的生成具有抑制作用，采用TBA熒光光度法測定時，這種抑制作用（略低于VC）強(qiáng)于采用TBA比色法（高濃度時顯著低于VC）。與比色法相比，化學(xué)發(fā)光法和熒光法用于分析花色苷類色素抗氧化能力的大小靈敏度高，選擇性強(qiáng)，能減少由于花色苷類色素自身在可見光區(qū)的光譜吸收對測定結(jié)果的干擾。

比色法，化學(xué)發(fā)光法，熒光法，紫甘薯紅色素，活性氧，丙二醛

紫甘薯（Ipornoea batatas L.）屬旋花科一年生草本植物，薯肉呈深紫紅色，富含天然花色苷類紅色素，是甘薯中特有的品種。文獻(xiàn)報道，紫甘薯紅色素的主要成分是酰基化的花青素苷及甲基花青素苷[1]，具有抗氧化、抑菌、防癌、保護(hù)肝臟、保護(hù)視力、抗突變、抗衰老、調(diào)節(jié)血壓、血糖和血脂水平等生理功能[1-3]，是一種具有廣闊開發(fā)利用前景的天然食藥兼?zhèn)涞摹肮δ苄允秤蒙亍辟Y源。

評價物質(zhì)抗氧化活性的方法很多，主要有比色法（分光光度法）、熒光化學(xué)發(fā)光法和熒光光度法等，其中大多采用比色法，因其所需儀器設(shè)備簡單，測定成本低，易實施。本課題組曾首次采用熒光化學(xué)發(fā)光法和熒光光度法對紫甘薯花色苷體外抗氧化活性進(jìn)行了實驗研究，表明紫甘薯花色苷在模型中表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)那宄钚匝醯哪芰鸵种菩∈蠼M織勻漿脂質(zhì)過氧化的能力[4]。為了避免單一方法研究紫甘薯紅色素抗氧化活性的局限性，并比較不同檢測方法的靈敏性和適用性，本實驗嘗試在同一體系模型下采用比色法、熒光化學(xué)發(fā)光法和熒光光度法分析紫甘薯紅色素的抗氧化能力，以期為評價天然花色苷類色素抗氧化能力檢測方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘薯 市售；雌性昆明種小鼠 體重（30±3g），購自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心；魯米諾（3-Aminophthalhydrazide，98%） 美國ACROS ORGANICS；硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA） Fluka產(chǎn)品；鄰苯三酚、EDTA、抗壞血酸、苯甲酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、三氯乙酸、H2O2、FeSO4等 均為分析純。

SP-2102U型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Fluoroskan Ascent FL型熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀 美國Thermo Electron Corporation；RF-5301型熒光分光光度計 日本島津公司；DY89-Ⅰ型電動玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝科器研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫甘薯紅色素的制備工藝流程[4]紫甘薯→清洗→切片→以料液比1∶3（g∶mL）加入0.5%鹽酸溶液浸提6h→過濾→二次浸提→過濾→合并濾液→AB-8大孔樹脂吸附→75%乙醇溶液洗脫→真空濃縮→噴霧干燥→樣品→備用。

用于本實驗的紫甘薯紅色素按上述制備工藝流程制備，色素粉色價為74.2（1%，530nm）。

1.2.2 肝組織勻漿的制備 取正常昆明種小鼠，禁食16h后，脫臼處死，迅速取出肝組織，用冷生理鹽水（4℃）洗凈血液，于冷生理鹽水中剪碎，加冷生理鹽水冰浴下于電動玻璃勻漿機(jī)中勻漿，制備10%肝組織勻漿，稀釋制備1%肝組織勻漿。

1.2.3 對活性氧的清除作用

1.2.3.1 對O2-·的清除作用 利用堿性鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生O2-·，分別采用比色法和魯米諾化學(xué)發(fā)光法測定色素對O2-·清除作用。

a.比色法：參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行測定。吸光度值均重復(fù)測定三次，取三次的平均值，清除率計算公式見式（1）。

式中，A0為空白吸光度值，Ai為樣品吸光度值。

b.魯米諾化學(xué)發(fā)光法：參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行測定。發(fā)光強(qiáng)度峰值均重復(fù)測定三次，取三次的平均值，清除率計算公式見式（2）。

式中，CP0為空白發(fā)光強(qiáng)度峰值，CPi為樣品發(fā)光強(qiáng)度峰值。

添加的色素溶液的濃度范圍均設(shè)為0.1～10mg/mL，以抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑。

1.2.3.2 對·OH的清除作用 利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，分別采用比色法、魯米諾化學(xué)發(fā)光法、苯甲酸熒光法測定色素對·OH的清除作用。

a.比色法：參照文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行測定。吸光度值均重復(fù)測定三次，取三次的平均值，清除率（%）的計算方法見式（1）。

b.魯米諾化學(xué)發(fā)光法：參照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行測定。發(fā)光強(qiáng)度峰值均重復(fù)測定三次，取三次的平均值，清除率（%）的計算方法見式（2）。

c.苯甲酸熒光法：參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行測定。熒光強(qiáng)度值均重復(fù)測定三次，取三次的平均值，清除率計算公式見式（3）。

式中，F(xiàn)0為空白熒光強(qiáng)度值，F(xiàn)i為樣品熒光強(qiáng)度值。

添加的色素溶液的濃度范圍均設(shè)為0.01～5mg/mL，以抗壞血酸（VC）為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑。

1.2.4 對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠組織勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用[7-8]TBA比色法和TBA熒光光度法測定色素對亞油酸脂質(zhì)體過氧化的抑制作用。

取1%新鮮肝組織懸浮液1mL，加入不同濃度的紫甘薯紅色素溶液0.2mL，再加入0.1mL 6mmol/L Fe2SO4，0.1mL 60mmol/L的H2O2，在37℃下水浴1h后，加入1mL 15%三氯乙酸（TCA）終止反應(yīng)，再加入1mL 6.7%硫代巴比妥酸（TBA），于沸水浴中顯色15min，冷卻后離心。對照用去離子水代替樣液，以抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑。按下述方法進(jìn)行測定其抑制作用。

a.TBA比色法：取上清液于722S分光光度計532nm下測定吸光度Ai值，重復(fù)測定三次，取三次的平均值，抑制率（%）的計算方法見式（1）。

b.TBA熒光光度法：取上清液于RF-5301熒光分光光度計上（波長：Ex=515.0nm，Em=553.0nm，狹縫：Ex=5.0nm，Em=3.0nm）測其熒光強(qiáng)度Fi，重復(fù)測定三次，取三次的平均值，抑制率（%）的計算方法見式（3）。

1.2.4 儀器處理方法 為防止玻璃儀器沾染有機(jī)物，本實驗中所用玻璃儀器均采用以下步驟處理：a.用洗液浸泡；b.自來水沖洗；c.發(fā)煙硝酸浸泡1h以上；d.蒸餾水漂洗干凈；e.蒸餾水煮沸；f.蒸餾水漂洗三次后使用。下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 對活性氧的清除作用

2.1.1 對O2-·的清除作用 比色法和魯米諾化學(xué)發(fā)光法測定的紫甘薯紅色素及標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑對照物VC對O2-·的清除能力的結(jié)果見圖1。

由圖1可見，在實驗濃度范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光法和比色法測定實驗結(jié)果均表明，紫甘薯紅色素和VC對由堿性鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的O2-·均具有清除作用，清除效果均隨其質(zhì)量濃度的增大而增大，但紫甘薯紅色素的清除效果低于VC，采用化學(xué)發(fā)光法測定的清除率數(shù)值均大于采用比色法，可知采用化學(xué)發(fā)光法時色素顯示出更強(qiáng)的清除O2-·能力。比色法，由于所需儀器設(shè)備簡單，測定成本低，易實施等諸多優(yōu)勢，目前是實驗室最常采用的物質(zhì)清除O2-·作用的測定方法，由實驗結(jié)果可知，跟比色法相比，化學(xué)發(fā)光法測定紫甘薯紅色素的清除能力靈敏度更高，檢測更快速。

圖1 不同檢測方法測定的色素對O2·-的清除作用Fig.1 Scavenging effect of the pigment on superoxide anion using different detection methods

2.1.2 對·OH的清除作用 在所有活性氧自由基中，·OH是最活潑也最具危害性的自由基，而且很難消除，已發(fā)現(xiàn)許多抗氧化劑清除O2-·，但卻不能清除·OH。比色法、魯米諾化學(xué)發(fā)光法、苯甲酸熒光法測定的紫甘薯紅色素及標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑對照物VC對·OH的清除能力的結(jié)果見圖2。

圖2 不同檢測方法測定的色素對·OH的清除作用Fig.2 Scavenging effect of the pigment on hydroxyl free radicals using different detection methods

由圖2可見，在實驗濃度范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光法、熒光法和比色法測定實驗結(jié)果均表明，紫甘薯紅色素和VC對由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH均具有清除作用，這種清除作用均隨其質(zhì)量濃度的增大而增大（除采用比色法測定色素的清除作用曲線外）。采用化學(xué)發(fā)光法和熒光法時，紫甘薯紅色素對·OH的清除效果高于VC，前者的這種差異更大，而采用比色法測定時，清除效果隨色素質(zhì)量濃度的增大先增大后降低，當(dāng)濃度小于1mg/mL時，清除效果高于VC，大于1mg/mL時低于VC，隨著濃度增大，清除率下降趨勢越大，這與化學(xué)發(fā)光法和熒光法的結(jié)果不同，作者認(rèn)為可能是因為比色法的測定波長在510nm處，紫甘薯紅色素自身在該波長有較強(qiáng)吸收（紫甘薯花色苷的最大吸收波長在530nm處[4]），所以當(dāng)濃度大于2mg/mL時，殘留的色素對實驗結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，使得清除率降低。

由此可知，采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法、苯甲酸熒光法和比色法測定相同濃度的色素清除·OH的能力大小時，結(jié)果存在差異，化學(xué)發(fā)光法得出的清除效果最好，熒光法次之，比色法最低，可知比色法不適合用于測定花色苷類色素對由Fenton反應(yīng)（細(xì)胞色素C-Cu2+-H2O2）產(chǎn)生的·OH的清除作用。

2.2 對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制作用

TBA比色法和TBA熒光光度法測定的紫甘薯紅色素及標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑對照物抗VC對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化抑制作用的結(jié)果見圖3。

圖3 不同檢測方法測定的色素對丙二醛生成的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of the pigment on the generation of MDA using different detection methods

由圖3可見，在實驗濃度范圍內(nèi)，TBA熒光光度法和TBA比色法測定實驗結(jié)果均表明，紫甘薯紅色素和VC對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的生成具有抑制作用，抑制效果均隨其質(zhì)量濃度的增大而增大（除采用TBA比色法測定色素的清除作用曲線外），熒光光度法測定的色素的抑制能力強(qiáng)于比色法，但均低于VC。TBA熒光光度法測定結(jié)果表明，高濃度的色素溶液的抑制效果好，如8mg/mL的色素溶液對丙二醛生成的抑制率達(dá)到90.2%，略低于相同濃度下VC的抑制率100%。TBA比色法測定結(jié)果表明，紫甘薯紅色素對丙二醛生成的抑制率低于VC，且隨其質(zhì)量濃度的增大先增大后降低，隨著濃度增大，清除率下降趨勢越大，作者認(rèn)為可能是因為比色法的測定波長在532nm處，即TBAMDA復(fù)合物在532nm處有最大吸收，而這與紫甘薯紅色素的最大吸收波長530nm幾乎吻合，所以當(dāng)濃度大于約1mg/mL時，殘留的色素對實驗結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，使吸光度值A(chǔ)i增大，從而清除率降低。

采用TBA熒光光度法和TBA比色法測定相同濃度的色素清除MDA的能力大小時，結(jié)果存在很大差異，TBA熒光光度法測定的清除率的數(shù)值較高，在高濃度時這種差異更大，可知TBA比色法不適合直接用于測定花色苷類色素對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛生成的抑制作用。

3 結(jié)論

紫甘薯紅色素對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的O2-·具有一定的清除作用，但低于對照抗壞血酸（VC），采用化學(xué)發(fā)光法測定時這種清除效果強(qiáng)于采用比色法；色素對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH具有清除作用，采用化學(xué)發(fā)光法測定時這種清除效果最高（高于VC），熒光法次之（稍高于VC），比色法最差（高濃度時顯著低于VC）；色素對Fe2+-H2O2誘導(dǎo)小鼠肝組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的生成具有抑制作用，采用TBA熒光光度法測定時這種抑制作用（略低于VC）強(qiáng)于采用TBA比色法（高濃度時顯著低于VC）。

通過對紫甘薯紅色素對活性氧自由基的清除能力和對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛生成的抑制作用的測定，結(jié)果表明，與比色法相比，化學(xué)發(fā)光法和熒光法表現(xiàn)出靈敏度高，選擇性強(qiáng)，檢測快速，能減少由于色素自身在可見光區(qū)的光譜吸收對測定結(jié)果的干擾。因此，化學(xué)發(fā)光法和熒光法適合用于對花色苷類色素抗氧化能力的分析。

[1]胡林子，馬永全，于新.紫甘薯色素抗菌及抗氧化作研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011（2）：389-392.

[2]Anthocyanins from pigmented potato（Solanum tuberosum L.）varieties[J].Food Res Int，2005，38：943-948

[3]Yoshimoto M，Okuno S，Kumagai T，et al.Distribution of anthocyanin pigments in storage root of purple-coloreded sweet potato，Ayamurasaki[J].Sweetpotato Research Front，1999（8）：2-3

[4]呂曉玲，孫曉俠，姚秀玲.采用熒光化學(xué)發(fā)光法分析紫甘薯花色苷產(chǎn)品的抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（9）：53-57.

[5]王慧琴，謝明勇，付志紅.紅花紅色素的抗氧化活性[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報，2003，22（5）：98-101.

[6]陳偉，孟憲軍，趙滿玲.不同方法測定玫瑰花紅色素抗氧化性[J].食品科學(xué)，2008，29（1）：273-276.

[7]龐戰(zhàn)軍，周玫，陳媛.自由基醫(yī)學(xué)研究方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：64-66.

[8]徐曉云，潘思軼，謝筆鈞，等.沙棘籽原花青素體外抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2005，26（2）：216-218.

Antioxidation analysis of red pigment from purple sweet potato by different test methods

SUN Xiao-xia，WANG Gai-ling，WU Shan-shan，QIAN Shi-quan，MA Long，XU Hui
（Department of Biology and Food Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

The scavenging ability on ROS and products of lipid peroxidation of red pigment from purple sweet potato was analysed by means of colorimetry（spectrophotometry），chemiluminescence，fluorospectrophotometry，in models for generation of superoxide anion，hydroxyl radicals malonaldehyde（MDA）.The results showed that the red pigment had certain scavenging effects on superoxide anion produced by pyrogallol autoxidation system，but lower than L-Ascorbic acid（VC），and the scavenging effects determined by chemiluminescence was stronger than colorimetry.The pigment had scavenging effects on hydroxyl free radical produced by Fenton reaction，and the effects determined by chemiluminescence（stronger than VC）was the strongest，next fluorescence（stronger slightly than VC），final colorimetry（lower evidently than VCat high concentrations）.The pigment also had inhibitory action on generation of MDA，the production of lipid peroxidation induced by Fe2+-H2O2on rat liver tissue homogenates in vitro，and the action determined by TBA fluorospectrophotometry（lowerer slightly than VC）was stronger than TBA colorimetry（lower evidently than VCat high concentrations）. Compared with colorimetry，chemiluminescence and fluorescence had high sensitivity and strong selectivity，and overcome the interference from spectral absorption of the pigment at the visible light on the test results.

colorimetry；chemiluminescence；fluorescence；red pigment from purple sweet potato；ROS；malonaldehyde

TS202.3

A

1002-0306（2014）12-0087-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.009

2013－07－30

孫曉俠（1979-），女，碩士研究生，助教，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分。

安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目（KJ2011B089）；食品科學(xué)與工程省級教學(xué)團(tuán)隊（20101094）。