實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在乳品微生物學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

朱軍偉，杭 鋒，王欽博，宋 馨，侯建平

(光明乳業(yè)股份有限公司，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436)

傳統(tǒng)的定量檢測方法依靠特定的微生物培養(yǎng)基對食品中活菌進(jìn)行分離和計數(shù)，測試過程需進(jìn)行培養(yǎng)基準(zhǔn)備、平板培養(yǎng)、菌落計數(shù)、生化鑒定等步驟，所以整個檢測顯得復(fù)雜、費(fèi)時［1-2］。當(dāng)前食品中病原菌的分子生物學(xué)檢測方法已極大縮短了獲得檢測結(jié)果的時間，這既能保證食品工業(yè)的產(chǎn)能提速，同時又能保持其所有食品安全要求。如今，基于聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測食源性微生物病原菌已經(jīng)獲得了國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)認(rèn)可［3-5］。

傳統(tǒng)的微生物方法無法檢測一些有活性但很難培養(yǎng)的微生物，而分子生物學(xué)方法卻能實(shí)現(xiàn)。此外，最新的分子生物學(xué)方法利用熒光染料特異性摻入DNA雙鏈，可以準(zhǔn)確地計算活性微生物菌群的數(shù)量。

在乳品工業(yè)中，微生物技術(shù)常被應(yīng)用于食源性病原菌的檢測和有益微生物如發(fā)酵微生物、益生菌的定量。由于益生菌和乳酸菌在乳制品中同時存在，如何準(zhǔn)確地計數(shù)每種益生菌和乳酸菌的數(shù)量給乳品工業(yè)帶來了一個巨大挑戰(zhàn)。乳品微生物學(xué)需要具有高鑒別能力的方法，進(jìn)而量化諸如乳制品和糞便等復(fù)雜系統(tǒng)中的益生菌數(shù)量，并追蹤其在食物鏈中存活能力的相關(guān)信息。因此，國內(nèi)外研究人員正在研究基于PCR的分子學(xué)方法以期能準(zhǔn)確定量活菌數(shù)量，還可以在單一反應(yīng)體系中檢測多個微生物數(shù)量，且能構(gòu)建高通量PCR流程［6-8］。目前，該方法已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，筆者就實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在乳品微生物學(xué)中的最新研究進(jìn)行了綜述，并對其作用機(jī)理進(jìn)行闡述，期望能給實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在乳品工業(yè)中的推廣使用提供一定的理論支持。

1 實(shí)時熒光定量PCR概述

1.1 實(shí)時熒光定量PCR的基本原理 實(shí)時熒光定量PCR(real-time fluomgenetic quantitative PCR)是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)(染料或探針)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法［8-10］。

熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。熒光探針是在探針的5＇端標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)(R)，3＇端標(biāo)記一個淬滅基團(tuán)(Q)，兩者可構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)，即5＇端熒光報告基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被3＇端淬滅基團(tuán)吸收或抑制，當(dāng)兩者距離較遠(yuǎn)時，抑制作用消失，報告基團(tuán)熒光信號增強(qiáng)，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可收到熒光信號。

定量的原理:靶基因初始拷貝數(shù)越多，所產(chǎn)生的循環(huán)閾值(cycle threshold，CT)越小。這里有2個問題需要明確:①熒光閾值的設(shè)定。在定量PCR中，需要經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后熒光信號才能夠被檢測到，一般以前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。②CT值為PCR過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)。根據(jù)熒光產(chǎn)生的原理，可將實(shí)時熒光定量PCR分為不同類型［9-10］(表1)。

1.2 實(shí)時熒光定量PCR的特點(diǎn) 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)與傳統(tǒng)定量PCR技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)［11］:①實(shí)時定量PCR不需要PCR后處理，所以可避免PCR的實(shí)驗(yàn)室污染，大大減少因交叉污染引起的假陽性錯誤。②可用β-actin基因序列對樣本的擴(kuò)增效率進(jìn)行標(biāo)化。在產(chǎn)物積聚的對數(shù)期進(jìn)行實(shí)時分析，允許對多種不同的基因進(jìn)行同時分析，而不必考慮“平臺效應(yīng)”對試驗(yàn)結(jié)果的影響。③節(jié)省了PCR后處理的時間，樣本通量大大提高。④實(shí)時定量PCR無需內(nèi)標(biāo)，具有高度重復(fù)性，可對每個樣本進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增以減少潛在錯誤。⑤實(shí)時定量PCR有很大的動力學(xué)范圍(接近1×106)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線對靶序列進(jìn)行檢測時，可對任何未知樣本進(jìn)行定量，循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)和相關(guān)的DNA模板拷貝數(shù)呈線性相關(guān)。

另外，實(shí)時定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量PCR只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在計算機(jī)軟件之中，通過對每個樣品循環(huán)閾值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果［12-16］。

表1 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分類

2 實(shí)時熒光定量PCR在乳品微生物學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

2.1 實(shí)時熒光定量PCR在益生菌檢測中的應(yīng)用 根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)對益生菌的定義［17］，它是指一類活的微生物，當(dāng)攝入一定數(shù)量時，對宿主的健康有益。益生菌對宿主健康的積極作用還和其應(yīng)用劑量緊密相關(guān)。宿主體內(nèi)益生菌數(shù)量極其重要，那么要保證其劑量，就需要保證產(chǎn)品貨架期內(nèi)益生菌的存活數(shù)量及其在宿主腸道內(nèi)的存活量;與此同時，益生菌也可在宿主回腸末端或大腸中自行繁殖到足夠劑量，從而發(fā)揮益生作用。

幾項研究結(jié)果表明，使用一些發(fā)酵微生物作為發(fā)酵乳中的益生菌在預(yù)防和治療某些疾病方面呈現(xiàn)出顯著有益的臨床效應(yīng)。Heyman等研究表明，益生菌對于預(yù)防和治療腹瀉效果明顯［18］。Mustapha等研究表明，益生菌的存在可以改善乳糖不耐癥患者對于乳糖的消化［19］。益生菌在預(yù)防和治療過敏性、炎癥性腸病中能發(fā)揮積極作用［20-21］。

益生菌鑒定和計數(shù)的傳統(tǒng)方法是通過生化、形態(tài)學(xué)及選擇性培養(yǎng)等方法進(jìn)而區(qū)分不同益生菌的表型特征［22］。

隨著雙歧桿菌在益生菌產(chǎn)品中的廣泛使用，建立一種快速的定性且定量檢測市售產(chǎn)品中雙歧桿菌的方法顯得極其重要。最新的一些研究成果表明，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)為乳品中發(fā)酵微生物和益生菌的定量檢測提供了全新的方法，從而減少檢測時間與勞力消耗［23］。

王立平等建立了發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌種類和數(shù)量快速測定方法［24］。以發(fā)酵乳中雙歧桿菌為靶標(biāo)，采用PCRDGGE技術(shù)快速識別雙歧桿菌種類;采用實(shí)時熒光定量PCR手段測定雙歧桿菌數(shù)量。研究結(jié)果表明，PCR-DGGE能準(zhǔn)確、快速鑒別雙歧桿菌種類，檢出限為105CFU/g;實(shí)時熒光定量PCR能準(zhǔn)確、快速定量雙歧桿菌，檢出限為104CFU/g。該方法可用于發(fā)酵乳中雙歧桿菌的快速識別和定量。

Masco等以16s rDNA或recA為目標(biāo)基因分別設(shè)計引物，再進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析，對29種益生菌產(chǎn)品中的雙歧桿菌進(jìn)行了定量檢測［25］。2種實(shí)時定量PCR方法都很快速，且定量結(jié)果都很相近，只有在檢測含益生菌較少的產(chǎn)品時，以16s rDNA為目標(biāo)基因的定量更為靈敏。

Sheu等以tuf為目標(biāo)基因設(shè)計引物進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)，能有效地檢測到益生菌產(chǎn)品中的雙歧桿菌;此外，還能檢測到存活的雙歧桿菌數(shù)量以及原有雙歧桿菌總數(shù)量，與平板計數(shù)法所得數(shù)目基本一致［26］。此研究為檢查益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量提供了一種行之有效的方法。

Herbel等以hsp60為目標(biāo)基因設(shè)計引物建立實(shí)時熒光定量PCR流程以檢測酸奶中5種重要的益生乳桿菌屬［27］。通過此法的最低檢測限為105CFU/ml，這對于市售酸奶制品來說已經(jīng)是相當(dāng)高效。因此，通過合理設(shè)計引物建立實(shí)時熒光定量PCR可以更準(zhǔn)確、快速和靈敏地檢測和定量市售產(chǎn)品中益生菌含量。

García等建立了一種核酸染料 propidium monoazide(PMA)與定量PCR技術(shù)聯(lián)合選擇性檢測發(fā)酵乳制品中活性乳酸菌和雙歧桿菌的技術(shù)(PMA-qPCR)［28］。結(jié)果表明，PMA-qPCR技術(shù)既能夠有效區(qū)分活性菌與非活性菌，又能區(qū)別活性乳酸菌和活性雙歧桿菌，同時還能快速有效地計數(shù)2種活性菌的數(shù)量。與平板計數(shù)法相比，檢測時間由72 h縮短至3 h左右。

Desfossés等首度通過PMA-qPCR技術(shù)監(jiān)測切達(dá)干酪制作以及成熟過程中益生菌菌群(主要分析植物乳桿菌和雙歧桿菌)的存活性能［29］。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)分子技術(shù)相比，PMA-qPCR技術(shù)更具特異性和準(zhǔn)確性。

因此，PMA-qPCR技術(shù)在發(fā)酵乳制品或者干酪中益生菌的鑒定和定量中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR在發(fā)酵乳制品乳酸菌檢測中的應(yīng)用 Sheu等通過tuf基因設(shè)計引物開發(fā)了多重非定量PCR技術(shù)，可以用于同時檢測市售乳制品中嗜乳酸桿菌、干酪乳桿菌群、德氏乳桿菌以及長雙歧桿菌［30］。然而，很少有研究報道如何既能檢測乳制品中乳酸菌又能對其進(jìn)行定量。

Furet等開發(fā)并評估了一種實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于特異性檢測和定量市售發(fā)酵乳制品中乳酸菌菌群(嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、約氏乳酸桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)的數(shù)量，并與傳統(tǒng)平板計數(shù)法進(jìn)行比較［31］。結(jié)果表明，實(shí)時熒光定量PCR不僅可以鑒定發(fā)酵乳制品原有的乳酸菌菌群種類，還可以準(zhǔn)確地定量各不同菌群的菌體數(shù)量。

吳榮榮等采用實(shí)時熒光定量PCR分析了酸乳中的德氏乳桿菌L2和嗜熱鏈球菌S1的數(shù)量［32］，德氏乳桿菌L2的活菌數(shù)與細(xì)胞循環(huán)數(shù)的相互關(guān)系曲線為Y=-2.936logX+34.72(R2=0.998)，采用平板計數(shù)法獲得的樣品中L2濃度為8.82×108ml，熒光定量的結(jié)果是8.78×108ml;嗜熱鏈球菌S1活菌數(shù)與細(xì)胞循環(huán)數(shù)的相互關(guān)系曲線為Y=-3.039logX+35.45(R2=0.995)，采用平板計數(shù)法，獲得的樣品中嗜熱鏈球菌S1濃度1.08×108ml，熒光定量的結(jié)果是1.06×108ml。實(shí)時熒光定量的方法適合于酸乳中乳酸菌的快速計數(shù)。

2.3 實(shí)時熒光定量PCR在干酪制品微生物檢測中的應(yīng)用 在干酪的成熟過程中，參與發(fā)酵過程的有益微生物對于最終成品干酪的風(fēng)味品質(zhì)尤為重要。由于缺少可供選擇的媒介，量化干酪表面的細(xì)菌非常困難，因此干酪表面的微生物菌群生態(tài)系統(tǒng)還得不到廣泛研究。

Monnet等開發(fā)了SYBR Green I實(shí)時熒光PCR方法用來定量市售涂抹型干酪上的干酪棒狀桿菌［33］。此方法有助于研究涂抹型干酪的生態(tài)系統(tǒng)以及干酪棒狀桿菌的功能特性。

卡門培爾青霉和婁地青霉在霉菌表面成熟干酪和藍(lán)紋干酪的成熟過程中起到了至關(guān)重要的作用。G.Le Dréan等開發(fā)了qRT-PCR技術(shù)，為干酪生產(chǎn)廠家提供了一種簡便且靈敏的檢測方法，即通過卡門培爾青霉和婁地青霉的成長動力學(xué)，進(jìn)而很好地理解微生物變化與生物化學(xué)變化兩者之間的關(guān)系［34］。

Ladero等利用高效液相色譜法(HPLC)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對不同市售干酪中組胺及組胺產(chǎn)生的細(xì)菌含量分別進(jìn)行了分析測定［35］。即使在干酪的生產(chǎn)過程中，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)可以在組胺水平積累到不可接受程度之前檢測到組胺產(chǎn)生菌株的含量，這就能有效解決高效液相色譜法只能檢測干酪中組胺含量而不能檢測產(chǎn)生組胺的細(xì)菌數(shù)量的問題。

Achilleos等以tuf為目標(biāo)基因開發(fā)了2種實(shí)時熒光定量PCR方法來定量研究干酪樣品中乳酸乳球菌和副干酪乳桿菌2種菌群的數(shù)量［36］。結(jié)果表明，此方法能極為有效地定量干酪中乳酸乳球菌菌群的數(shù)量，而對于副干酪乳桿菌菌群的計數(shù)卻無法達(dá)到理想效果。

Zago等以pheS為目標(biāo)基因開發(fā)了一種實(shí)時熒光定量PCR方法來特異性檢測定量干酪中的一類有益微生物——灰黃色腸球菌(Enterococcus gilvus)，其檢測限可達(dá)到104CFU/g［37］。此方法有助于檢測和定量干酪中的灰黃色腸球菌，進(jìn)而更好地理解其在干酪以及其他發(fā)酵食品中所起到的技術(shù)作用和安全性作用。

Martín等以 lacZ為目標(biāo)基因設(shè)計引物，基于 SYBR Green I建立實(shí)時熒光定量PCR流程來定量檢測干酪中的所有大腸菌群，且整個流程僅需花費(fèi)10～12 h［38］。

3 小結(jié)與展望

該研究中所提到的大多數(shù)研究案例以及最新的研究進(jìn)展說明實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在乳品微生物學(xué)中的應(yīng)用才剛剛起步，許多國內(nèi)外學(xué)者正致力于其廣泛應(yīng)用。未來在這一領(lǐng)域的發(fā)展是希望通過此技術(shù)能夠給乳品工業(yè)化過程中微生物風(fēng)險評估提供有利的信息。當(dāng)然，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，不能與其他傳統(tǒng)和分子學(xué)方法相脫離，而應(yīng)該與他們結(jié)合起來以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢互補(bǔ)。

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