間歇低氧合并肺氣腫大鼠系統(tǒng)與內(nèi)皮炎癥狀態(tài)及外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞水平研究*

王 彥 曹 潔 楊慶嬋 馮 靖△ 陳寶元

阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）和慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是最常見(jiàn)的兩種慢性呼吸系統(tǒng)性疾病。COPD和OSA共存稱(chēng)為呼吸重疊綜合征（OS）[1]。COPD和OSA都與許多炎性細(xì)胞因子激活增加和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，因此COPD和OSA都是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[2]。系統(tǒng)和內(nèi)皮炎癥導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展初期涉及腫瘤壞死因子-α（TNF-α)和白介素-6（IL-6），這個(gè)過(guò)程促進(jìn)了白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞滾動(dòng)和黏附，并在RhoA的協(xié)助下，單核細(xì)胞和T細(xì)胞穿透血管壁，在這里單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，攝取氧化脂質(zhì)并形成泡沫細(xì)胞。這些細(xì)胞聚集形成脂類(lèi)池，這就是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及隨后發(fā)生心血管疾病的核心成分[2]。COPD和OSA的關(guān)系僅僅是兩種常見(jiàn)臨床癥狀的簡(jiǎn)單相加？還是對(duì)系統(tǒng)性炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化甚至心血管疾病有協(xié)同作用？目前仍然存在一些爭(zhēng)論[3]。本研究通過(guò)建立間歇低氧（IH）合并肺氣腫大鼠模型，觀察OS大鼠系統(tǒng)和內(nèi)皮炎癥狀態(tài)以及內(nèi)皮修復(fù)能力的損傷程度，探討IH合并肺氣腫對(duì)心血管疾病的協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性4周齡Wistar大鼠60只，體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK津2010-0002），飼養(yǎng)于清潔無(wú)菌的二級(jí)動(dòng)物房。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)我院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和儀器 （1）大前門(mén)烤煙型香煙（天津卷煙廠）；混合氣體（天津六方氣體公司）；HE染色液，ELISA試劑盒（南京建成生物科技公司）。（2）熏煙箱（容積約72 L）和密封箱均為儲(chǔ)物箱和大號(hào)密封盒改制；氧濃度檢測(cè)儀（瑞士夏美頓公司）；低流量流速表（余姚工業(yè)自動(dòng)化儀表廠）；氧氣減壓器（天津減壓器廠）；血?dú)夥治鰞x（瑞士羅氏AVL995）；日本Olympus光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)；北京航空航天大學(xué)多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)；FACScalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Cell-Quest和Paint-a-Gate軟件（Becton Dickinson,San Jose, CA,USA）。

1.2 方法

1.2.1 OS大鼠模型的建立及分組 通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行16周的熏煙暴露造成大鼠肺氣腫，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行IH暴露。根據(jù)暴露條件將其分為4組，每組15只。對(duì)照組（A組）：假熏煙暴露和間歇正常氧暴露；IH組（B組）：假熏煙暴露和IH暴露；肺氣腫組（C組）：熏煙暴露和間歇正常氧暴露；OS組（D組）：熏煙暴露和IH暴露。

1.2.2 動(dòng)物熏煙暴露 動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)鼠籠內(nèi)（每籠5只），自由攝食和飲水。熏煙暴露裝置和以往研究中的相似[4-5]。大鼠每天早晚（9:00前和17:00后）兩次于自制熏箱內(nèi)熏吸香煙共約1 h（每次約30 min），共暴露16周。每只煙含有18 mg焦油，通過(guò)同時(shí)燃燒5只香煙使飼養(yǎng)艙內(nèi)的煙霧體積分?jǐn)?shù)約為15%（V/V）。假熏煙暴露組大鼠暴露環(huán)境除了香煙燃燒外其他條件相同。

1.2.3 IH暴露 自13～16周，在熏煙暴露同時(shí)，每天9:00— 17:00（睡眠時(shí)段）將大鼠置于自制IH艙內(nèi)，向艙內(nèi)循環(huán)充入N2和空氣的混合氣，每一循環(huán)為120 s，30 s充入N2，使艙內(nèi)最低氧濃度在30 s內(nèi)達(dá)到5%，隨后90 s充入壓縮空氣，使氧濃度逐漸恢復(fù)至21%，氣流通過(guò)時(shí)間控制的電磁閥和氧流量表來(lái)調(diào)控。假I(mǎi)H暴露組的暴露條件除了把N2換成清潔空氣外，其他條件相同。

1.2.4 大鼠睡眠結(jié)構(gòu)分析 實(shí)驗(yàn)暴露前1周，隨機(jī)抽取5只大鼠監(jiān)測(cè)大鼠腦電圖證明大部分大鼠在9:00～17:00處于睡眠狀態(tài)，符合Wistar大鼠的基本生理狀態(tài)。

1.2.5 血?dú)夥治?于暴露結(jié)束前2 d（第110天），每組隨機(jī)取5只大鼠以10%水合氯醛（0.1 mL/100 g腹腔注射）輕度麻醉后暴露右股動(dòng)脈，分別于以下幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)取動(dòng)脈血0.7 mL檢測(cè)各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓p(O2)，動(dòng)脈血二氧化碳分壓p(CO2)，動(dòng)脈血氧飽和度（SaO2）和pH值。時(shí)間點(diǎn)：（1）對(duì)照組大鼠慢波睡眠時(shí)。（2）肺氣腫組大鼠慢波睡眠時(shí)。（3）IH組大鼠慢波睡眠時(shí)IH暴露低氧階段p(O2)最低點(diǎn)。（4）IH組大鼠慢波睡眠時(shí)IH暴露復(fù)氧階段p(O2)最高點(diǎn)。（5）OS組大鼠慢波睡眠時(shí)IH暴露低氧階段p(O2)最低點(diǎn)。（6）OS組大鼠慢波睡眠時(shí)IH暴露復(fù)氧階段p(O2)最高點(diǎn)。

1.2.6 標(biāo)本的留取與處理 將各組剩余的10只大鼠麻醉后以仰臥位固定在操作臺(tái)，每只大鼠用含有200 μL10% EDTA的注射器收集靜脈血8～10 mL，在室溫下?lián)u晃注射器待下一步處理（＜1 h）[4]。收集完血清后暴露頸部與肺臟，取頸動(dòng)脈及肺組織各1塊，置4%甲醛溶液中固定，24 h內(nèi)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。隨后縱向剖開(kāi)頸總動(dòng)脈并刮取內(nèi)皮細(xì)胞層，以RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/mL，1 mL/孔接種于6孔板，然后放入標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)箱2 h待測(cè)。

1.2.7 TNF-α、IL-6、RhoA水平檢測(cè) 用ELISA試劑盒測(cè)量血漿及頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6的蛋白水平，然后用PBS沖洗并重懸內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，從貼壁細(xì)胞中提取總RNA，采用Real-time PCR法測(cè)定RhoA mRNA表達(dá)水平。RhoA引物：上游5′-ATGTGCCCACAGTGTTTGAGAAC-3′，下游5′-TCAGTTCGTAAAGACAGGGTTGC-3′；產(chǎn)物345 bp。GAPDH引物：上游5′-TATTGGGCGCCTGGTCACCA-3′，下游5′-CCACCTTCTTGATGTCATCA-3′；產(chǎn)物726 bp。

1.2.8 頸總動(dòng)脈炎癥評(píng)分方法 使用病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每只大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（IMT）占全層厚度的比值，以C-IMT%表示。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）水平 取大鼠頸靜脈血4 mL與Histopaque 1083進(jìn)行密度梯度離心，取單核細(xì)胞（PBMC）富集層。PBMC涂片經(jīng)吉姆薩染色并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，以臺(tái)盼藍(lán)不相容實(shí)驗(yàn)確定其生存率至少為98%方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算PBMC的總數(shù)。然后將PBMC重懸，細(xì)胞數(shù)調(diào)整到1×104/μL，取100 μL PBMC懸浮液，加入PerCP標(biāo)記的7-氨基放線菌素D（7-AAD）、FITC標(biāo)記的鼠抗兔CD 34和PE標(biāo)記的鼠抗兔CD 133共5 μL，混勻后4℃避光孵育20 min，完成后加入2 mL的1∶10稀釋的FACS液，將剩余的紅細(xì)胞溶解，再重新孵育10 min，用2%PBS/BSA（pH=7.4）2 mL洗滌剩余的PBMC，500×g離心5 min，最后用500 μL PBS重懸，再用FACScalibur流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Cell-Quest和Painta-Gate軟件計(jì)數(shù)分析。以血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算血細(xì)胞總數(shù)。最初通過(guò)分析同型對(duì)照組抗體來(lái)確定背景水平，細(xì)胞碎片和凋亡細(xì)胞通過(guò)7-AAD/FSC可以排除，計(jì)算CD34+VEGFR2+雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例，以此表示EPC數(shù)量[6]。結(jié)果以每μL全血中PBMC數(shù)量×EPC百分比表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)試驗(yàn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果 預(yù)實(shí)驗(yàn)各組大鼠的血?dú)庵狄?jiàn)表1。A組大鼠數(shù)據(jù)基本符合正常生理狀態(tài)下的血?dú)庵?；C組p(O2)略有下降，基本符合大鼠肺氣腫的狀態(tài)；B組和D組大鼠低氧階段p(O2)＜60 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），基本符合大鼠IH的狀態(tài)。

Table 1 The blood gas analysis of preliminary experiment表1 預(yù)試驗(yàn)血?dú)夥治鼋Y(jié)果

2.2 肺組織學(xué)評(píng)價(jià) C組和D組大鼠的病理學(xué)特征更明顯，表現(xiàn)為炎細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡平均截距增加和每個(gè)視野平均肺泡數(shù)量的減少，符合肺氣腫形成標(biāo)準(zhǔn)。各組肺組織的病理圖片見(jiàn)圖1。

Figure 1 The pathological images of lung tissues between different groups（HE，×40）圖1 各組大鼠肺組織病理圖片（HE，×40）

2.3 各組血漿中TNF-α和IL-6水平比較 血漿中TNF-α和IL-6的濃度均是D組＞C組＞B組＞A組（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 各組右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6水平比較 右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6的相對(duì)濃度均是D組＞C組＞B組＞A組（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.5 各組右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RhoA mRNA表達(dá)水平比較 右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RhoA mRNA表達(dá)水平也是D組＞C組＞B組＞A組（均P＜0.05），見(jiàn)圖4。

2.6 右頸總動(dòng)脈C-IMT% 右頸總動(dòng)脈C-IMT%是D組最高，A組最低（均P＜0.05）。C組與B組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.061），見(jiàn)圖5。光鏡下右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞病理圖片，見(jiàn)圖6。

Figure 2 Comparison of plasma levels of TNF-α and IL-6 between four groups圖2 各組大鼠血漿中TNF-α和IL-6水平比較

Figure 3 The TNF-α and IL-6 levels in the endothelium of right common carotid artery圖3 右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α和IL-6水平

2.7 外周血EPC相對(duì)濃度 D組EPC相對(duì)濃度最低，A組最高，B組低于C組（均P＜0.05），見(jiàn)圖7。各組EPC流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。

Figure 4 The expression level of RhoA mRNA expression in the endothelium of right common carotid artery圖4 右頸總動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RhoA mRNA表達(dá)水平

Figure 5 Comparison of C-IMT%in the endothelium of right common carotid artery圖5 各組右頸總動(dòng)脈C-IMT%比較

Figure 6 The pathological images of right common carotid artery in different groups of rats（HE，×40）圖6 各組大鼠右頸總動(dòng)脈病理圖片（HE，×40）

3 討論

COPD和OSA在臨床實(shí)踐中是非常常見(jiàn)的疾病，而OS這一名詞常用于這兩種疾病的并存狀態(tài)[1]。本研究通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的熏煙暴露并經(jīng)病理確認(rèn)建立肺氣腫模型，然后根據(jù)國(guó)際睡眠障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)（第二版）[7]在大鼠睡眠期間進(jìn)行低氧暴露，成功地在肺氣腫大鼠上模擬了IH，因此建立了OS大鼠模型。該模型是肺氣腫和睡眠低氧的合并，并不是真正的OS。本研究的暴露模式形成統(tǒng)一的低氧嚴(yán)重程度和時(shí)間，在方法上是合理可行的，且代表了IH的某些病理特征[4]。

動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病是COPD和OSA的主要合并癥[2]。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中，從脂肪紋理啟動(dòng)到后期的斑塊破裂，炎癥發(fā)揮了關(guān)鍵作用。OSA與COPD都與系統(tǒng)性炎癥有關(guān)，涉及到C-反應(yīng)蛋白（CRP）、IL-6和核因子-κB（NF-κB）依賴通道（該通道涉及TNF-α和IL-8）。這種系統(tǒng)炎癥有可能是這兩種疾病之間相互作用的基礎(chǔ)。而且，這兩種疾病均有氧化應(yīng)激，可激活循環(huán)白細(xì)胞或者使循環(huán)白細(xì)胞功能障礙。這些發(fā)現(xiàn)與臨床密切相關(guān)，因?yàn)橄到y(tǒng)炎癥可能參與了心血管疾病的發(fā)生[2]。但是OSA和COPD之間的相關(guān)性僅僅是兩種相對(duì)常見(jiàn)臨床疾病的簡(jiǎn)單相加，還是彼此加重了另一種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，目前還存在一些爭(zhēng)議。

Figure 7 Comparison of EPC level in peripheral blood between four groups圖7 各組大鼠外周血EPC比較

Figure 8 Results of EPC detected by flow cytometry in four groups圖8 各組EPC流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果

TNF-α和IL-6是兩種最主要的與動(dòng)脈粥樣硬化和其他炎癥疾病相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，而高水平的TNF-α和IL-6與冠脈不良事件增加相關(guān)，它們可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移到內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞下，之后單核細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。本研究證明OS組比IH或肺氣腫組的血漿及內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α和IL-6水平均有顯著升高，提示IH與肺氣腫可以協(xié)同加重系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重。研究報(bào)道OSA和COPD患者TNF-α、IL-6均升高[8]，與本研究結(jié)果一致。系統(tǒng)低氧血癥參與COPD患者TNF-α的增加，這一效應(yīng)與OS密切相關(guān)，因?yàn)镺S低氧血癥更加嚴(yán)重。整體上講，低氧對(duì)COPD和OSA患者TNF-α的激活起關(guān)鍵作用。這樣，TNF-α和相關(guān)細(xì)胞因子水平在OS患者中應(yīng)特別高，因此在OS患者中與片段性IH相關(guān)的夜間SaO2下降可能對(duì)TNF-α水平的增加產(chǎn)生額外效應(yīng)。研究OS患者的這一通道對(duì)研究心血管疾病中NF-κB依賴通道的作用意義重大[2]。目前關(guān)于OS患者炎癥標(biāo)志物的研究很少。

TNF-α誘導(dǎo)NF-κB激活也涉及到RhoA。激活的RhoA使內(nèi)皮細(xì)胞收縮并增加其通透性，當(dāng)它與IH產(chǎn)生的高黏附力結(jié)合后，可使白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞更容易通過(guò)內(nèi)皮屏障。RhoA/RhoA激酶（ROCK）的作用是復(fù)雜的，缺血再灌注損傷后ROCK活性增加，并且促進(jìn)白細(xì)胞浸潤(rùn)，參與早期炎癥反應(yīng)。筆者以前的研究表明IH激活RhoA轉(zhuǎn)錄，然后通過(guò)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生IL-6等炎癥蛋白，其臨床意義在于OSA模式IH可以通過(guò)激活炎癥引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4]。此外，有研究報(bào)道RhoA蛋白表達(dá)在COPD組中也明顯高于對(duì)照組[9]。本研究比較4組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞RhoA mRNA水平發(fā)現(xiàn)OS組是最高的。低氧在COPD RhoA/ROCK途徑上調(diào)中發(fā)揮潛在性的作用，ROCK抑制劑法舒地爾可減輕內(nèi)皮損傷，并促進(jìn)肺血管重建，阻止慢性低氧介導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓[10]?；钚匝踝杂苫赡軈⑴c了包括RhoA/Rho激酶途徑在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活，但是確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步調(diào)查[9]。

IMT是動(dòng)脈粥樣硬化的一種替代測(cè)量方法，與心血管危險(xiǎn)因素及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)OSA患者的頸動(dòng)脈IMT高于正常對(duì)照組[11]，這可能與IH促進(jìn)白細(xì)胞滾動(dòng)、炎性細(xì)胞增殖、NF-κB激活、細(xì)胞間黏附因子-1及不同趨化因子表達(dá)增加有關(guān)。COPD患者的頸動(dòng)脈IMT也高于正常對(duì)照組，氣道炎癥可誘發(fā)系統(tǒng)炎癥，尤其是CRP產(chǎn)物與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)OS組C-IMT%水平最高，提示與僅僅患一種疾病相比，兩者并發(fā)時(shí)預(yù)后更差。

EPC是循環(huán)細(xì)胞的儲(chǔ)備池，可以歸巢至損傷部位并修復(fù)內(nèi)皮完整性及正常功能[6]，評(píng)估其炎癥損傷后的修復(fù)能力。循環(huán)EPC為抵抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷、替換功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞和增強(qiáng)缺血血管損傷后的組織修復(fù)提供了一個(gè)內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制。在本研究中OS、IH和肺氣腫大鼠EPC水平均減少，且OS大鼠水平最低，提示IH合并肺氣腫加重了內(nèi)皮修復(fù)能力的損害，兩者協(xié)同作用可增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。組織缺血和低氧反應(yīng)可以內(nèi)源性地調(diào)度EPC，主要通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和低氧誘導(dǎo)因子1α來(lái)介導(dǎo)，而這些因子通過(guò)IH也可以被激活[13]。IH可以通過(guò)動(dòng)員EPC進(jìn)入血液循環(huán)和損傷心肌組織發(fā)揮心肌保護(hù)作用并幫助冠脈血管的形成[14]。了解OSA和COPD重疊患者EPC的生物學(xué)特點(diǎn)，將有助于了解血管方面的發(fā)病機(jī)制并采取治療干預(yù)措施[15]。總之，無(wú)論這兩種疾病病因是否相關(guān)，OS患者夜間低氧血癥、高碳酸血癥和肺動(dòng)脈高壓都比OSA患者更重，這可能產(chǎn)生重要的臨床后果。例如，最近報(bào)道OS患者與僅患OSA和COPD的患者相比有更高的病死率[16]。這些臨床發(fā)現(xiàn)也許就是本基礎(chǔ)研究的意義所在。

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