MTHFR C677T基因多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌化療不良反應(yīng)的關(guān)系

寇軍燕 洪衛(wèi) 洪丹 蘇丹 婁廣媛 張沂平

1.杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤綜合科，浙江 杭州 310002；2.浙江省腫瘤醫(yī)院化療中心十六病區(qū)，浙江 杭州 310002；3.浙江省腫瘤醫(yī)院研究所，浙江 杭州 310022

MTHFR C677T基因多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌化療不良反應(yīng)的關(guān)系

寇軍燕1 洪衛(wèi)2 洪丹2 蘇丹3 婁廣媛2 張沂平2

1.杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤綜合科，浙江 杭州 310002；2.浙江省腫瘤醫(yī)院化療中心十六病區(qū)，浙江 杭州 310002；3.浙江省腫瘤醫(yī)院研究所，浙江 杭州 310022

背景與目的：亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，在DNA甲基化中起重要作用。本研究旨在探討MTHFR C677T多態(tài)性與晚期非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)化療不良反應(yīng)的關(guān)系。方法：收集2007年6月—2009年5月在浙江省腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診的晚期NSCLC患者100例。所有患者均接受鉑類藥物聯(lián)合吉西他濱的方案化療。用等位基因特異-PCR技術(shù)檢測(cè)患者M(jìn)THFR基因型。結(jié)果：100例晚期NSCLC患者中，MTHFR C677T T/T、T/C和C/C基因型頻率分別為20%、44%和36%。在血液學(xué)不良反應(yīng)中，C/C基因型血小板減少發(fā)生率較T/T、T/C基因型低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)。本研究未發(fā)現(xiàn)MTHFR各基因型與化療后惡心、嘔吐不良反應(yīng)相關(guān)。結(jié)論：MTHFR C677T基因多態(tài)性對(duì)預(yù)測(cè)晚期NSCLC含鉑類藥物方案化療后不良反應(yīng)有臨床意義。

亞甲基四氫葉酸還原酶；非小細(xì)胞肺癌；化療；鉑類；不良反應(yīng)

化療是治療肺癌的主要方法，尤其是對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，目前其標(biāo)準(zhǔn)化療方案是以鉑類藥物為基礎(chǔ)加第3代新藥的聯(lián)合化療。但同樣方案、同樣劑量強(qiáng)度的藥物給予不同患者，其療效和不良反應(yīng)差異很大，因此，尋找可靠的預(yù)測(cè)標(biāo)記，指導(dǎo)個(gè)體化治療，對(duì)于提高臨床用藥的有效性和安全性具有重要的意義。

亞甲基四氫葉酸還原酶(m e t h y l e n e tetrahydrofolate reductase， MTHFR)是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其基因有多種突變類型，最常見(jiàn)的是C677T點(diǎn)突變(丙氨酸→纈氨酸)。MTHFR活性的高低將影響基因組DNA的甲基化。體外研究已經(jīng)證明一些基因(如細(xì)胞周期關(guān)卡基因、DNA修復(fù)基因等)的異常甲基化可以影響細(xì)胞毒性藥物和干擾DNA合成藥物的敏感性及不良反應(yīng)［1-4］。本研究以浙江省腫瘤醫(yī)院100例晚期NSCLC接受以鉑類藥物為基礎(chǔ)聯(lián)合吉西他濱方案化療患者為研究對(duì)象，分析MTHFR C677T多態(tài)性與晚期NSCLC化療后不良反應(yīng)的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 患者資料

2007年6月—2009年5月，在浙江省腫瘤醫(yī)院化療科入組經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的ⅢB期或Ⅳ期晚期NSCLC患者105例(剔除接受維持化療或接受靶向藥物維持治療5例，納入分析100例)。其中男性70例，女性30例；年齡25～71歲，中位年齡56歲；患者均為漢族。臨床腫瘤分期采用2009年UICC分期。所有患者經(jīng)CT證實(shí)有可測(cè)量或可評(píng)估的病灶，最大徑＞1.5 cm；既往無(wú)化療史，允許先行放療，觀察病灶必須在放射野外；化療前PS評(píng)分≤2，心臟功能、肝腎功能、血常規(guī)正常；預(yù)計(jì)生存≥12周；能隨訪，依從性好(表1)。

表1 NSCLC患者的基本情況、化療方案及療效Tab. 1 Clinical characteristics, chemotherapy regimens and ef fi cacy of 100 patients with non-small cell lung cancer

1.2 樣本收集

所有患者化療前清晨空腹抽靜脈2 mL，置乙二胺四乙酸鈉抗凝管，分離白細(xì)胞層，置-74 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因型分析

采用由美國(guó)ZYMO RESEARCH公司生產(chǎn)的D3025 ZR Genomic DNAⅡ KitTM試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)步驟從肺癌全血標(biāo)本中提取高相對(duì)分子質(zhì)量DNA。單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)采用Taqman探針基因分型技術(shù)，在ABI 7500適時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀上完成(Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)oster City，CA)。探針、引物和Taqman通用PCR混合液均購(gòu)于美國(guó)ABI公司。PCR總反應(yīng)體系為5 μL，混合有0.25 μL的引物和探針，2.5 μLPCR反應(yīng)液和5 ng DNA。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃，10 min；92 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。每塊板上加2個(gè)無(wú)DNA空白標(biāo)本作為陰性對(duì)照。7500擴(kuò)增儀附帶的隨機(jī)軟件SDS等位基因分型軟件分析結(jié)果。MTHFR C677T基因型分為野生型純合子(C/C)、雜合子(T/C)、變異性純合子(T/T)3種類型。

1.4 治療方案

所有患者均接受吉西他濱為基礎(chǔ)的聯(lián)合方案化療，其中聯(lián)合順鉑(cisplatin，DDP)治療者68例(GP組)，聯(lián)合卡鉑(carboplatin，CBP)治療者32例(GC組)。化療方案為鉑類藥物加吉西他濱(gemcitabine，GEM)1 000 mg/m2靜脈滴注，第1、8天。鉑類藥物：DDP 75 mg/m2第1～3天或卡鉑AUC=5第1天，均為靜脈給藥。以上方案均每3周為1個(gè)周期，所有患者均在化療2個(gè)周期后評(píng)定療效。

1.5 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

療效評(píng)定采用RECIST標(biāo)準(zhǔn)分為完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、穩(wěn)定(stable disease，SD)和進(jìn)展(progressive disease，PD)。療效評(píng)價(jià)有效為CR+PR?；熀蟛涣挤磻?yīng)按照藥物評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)NCI-CTC 3.0評(píng)價(jià)(包括血液學(xué)、消化道不良反應(yīng))。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

不同基因型與消化道反應(yīng)、血液學(xué)毒性的比較均采用方差分析，生存研究比較采用Kaplan-Meier法Log-rank檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTHFR C677T基因型分布

在100例晚期NSCLC患者中，20例攜帶T/ T基因型，44例攜帶T/C基因型，36例攜帶C/C基因型。Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，MTHFR C677T基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入組患者具有群體代表性。

2.2 MTHFR C677T基因型與臨床療效

患者均進(jìn)入疾病進(jìn)展，截止隨訪時(shí)，28例仍存活。無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間1.5～18.0個(gè)月，中位5.0個(gè)月，平均5.7個(gè)月?？偵鏁r(shí)間2.0～33.0個(gè)月，中位10.0個(gè)月，平均11.4個(gè)月。100例患者中，療效評(píng)價(jià)有效33例，SD 55例，PD 12例，有效率33%，其中CR 3例。化療有效組33例患者中，T/T型4例(12.1%)，T/C型13例(39.4%)，C/C型16例(48.5%)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 MTHFR C677T基因型與生存期的關(guān)系

MTHFR C677T不同基因型患者無(wú)進(jìn)展生存期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.194)。其中，T/C型患者較其他基因型患者化療后無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間更長(zhǎng)，其他兩種基因型合并后與T/C型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.043，圖1)，雖然總生存差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075，圖2)，但是值得進(jìn)一步隨訪觀察。

圖1 合并后無(wú)進(jìn)展生存期的生存曲線Fig. 1 Survival curves after merger PFS

圖2 合并后總生存期的生存曲線Fig. 2 Survival curves after merger OS

2.4 MTHFR C677T基因型與惡心、嘔吐反應(yīng)的關(guān)系

在100例患者中，0度惡心、嘔吐反應(yīng)為58例，1～2度為23例，3度及以上為19例。初步分析，GP組有惡心、嘔吐反應(yīng)較大的傾向，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由于GC組樣本較小，故僅對(duì)GP組68例患者進(jìn)行分析。MTHFR C/C、T/C和T/T型與化療惡心、嘔吐反應(yīng)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.773，表2)。

2.5 MTHFR C677T基因型與血液學(xué)不良反應(yīng)的關(guān)系

初步分析，GP組外周血中性粒細(xì)胞和血小板減少的發(fā)生率更低。由于GC組患者數(shù)較少，同樣僅對(duì)GP組68例患者進(jìn)行分析。其中某些亞型樣本數(shù)較少，進(jìn)行適當(dāng)合并。各基因型與貧血之間相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.658，表3)，與中性粒細(xì)胞減少相關(guān)性差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.446，表4)；觀察發(fā)生血小板減少的比例，C/C型患者顯著高于T/C和T/T型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039，表5)。

表2 不同基因型與惡心、嘔吐反應(yīng)的關(guān)系Tab. 2 Relationship between MTHFR genotypes and nausea/vomiting

表3 不同基因型與貧血的關(guān)系Tab. 3 Relationship between MTHFR genotypes and Anemia

表4 不同基因型與中性粒細(xì)胞減少的關(guān)系Tab. 4 Relationship between MTHFR genotypes and of neutropenia

表5 不同基因型與血小板減少的關(guān)系Tab. 5 Relationship between MTHFR genotypes and thrombocytopenia

3 討 論

MTHFR在體內(nèi)有重要的生物學(xué)作用，是機(jī)體一碳單位代謝關(guān)鍵酶，也是甲硫氨酸代謝中的關(guān)鍵酶，可催化還原型輔酶Ⅱ相關(guān)的5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸。后者作為一碳單位的供體參與同型半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸。甲硫氨酸活化S-腺苷甲硫氨酸并作為甲基的供體參與許多代謝反應(yīng)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有多種突變類型，不同的基因突變類型對(duì)MTHFR的酶活性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生不同的影響，表現(xiàn)出各種不同的酶活性和熱穩(wěn)定性，提示MTHFR基因具有復(fù)雜的遺傳異質(zhì)性。MTHFR的基因型、酶活性和表型之間有密切的聯(lián)系。一般涉及進(jìn)化保守序列的突變會(huì)引起酶活性的急劇下降，危害性較大；相反，處于非保守序列的突變對(duì)酶的活性影響較小，危害性也較小。酶活性降低幅度越大，相應(yīng)的生化表現(xiàn)和臨床癥狀出現(xiàn)越早，程度越嚴(yán)重［5］。C677T點(diǎn)突變是MTHFR最常見(jiàn)的突變類型，已有的研究表明MTHFR 677C→T在不同國(guó)家、同一國(guó)家不同地區(qū)、同一地區(qū)不同民族或種族中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［6-7］。歐洲人677T等位基因頻率為22%～44%，在亞洲人中，日本人677T等位基因頻率為34%，中國(guó)漢族人為40%，因而認(rèn)為亞洲人MTHFR基因677C→T突變頻率偏高。

目前關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性與肺癌之間的關(guān)系研究較少，結(jié)論不一。Jeng等［8］在臺(tái)灣地區(qū)進(jìn)行的研究(59例患者和232名對(duì)照)未顯示MTHFR C677T基因多態(tài)性與肺癌發(fā)生相關(guān)。Siemianowicz等［9］的研究得出了不同的結(jié)論。他們檢測(cè)了146例肺癌患者和44名對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因中，TT型的表達(dá)在小細(xì)胞肺癌中為22.9%，在NSCLC中為36.0%，均高于對(duì)照組的13.6%；在小細(xì)胞肺癌和NSCLC兩組之間基因型的表達(dá)無(wú)明顯差異。西班牙學(xué)者Alberola等［10］以晚期NSCLC為對(duì)象研究了MTHFR C677T基因多態(tài)性與DDP/ GEM方案化療效果的關(guān)系，未發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C677T多態(tài)性與NSCLC化療效果之間有顯著關(guān)聯(lián)，但是C/C基因型比T/C及T/T基因型呈現(xiàn)出TTP延長(zhǎng)的傾向。本研究發(fā)現(xiàn)化療有效的33例患者中，MTHFR C677T C/C型與化療近期有效率高相關(guān)，而無(wú)進(jìn)展生存期，T/C型較其他基因型患者更長(zhǎng)，且總生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，值得進(jìn)一步隨訪觀察。

本研究主要化療方案為鉑類聯(lián)合吉西他濱，其中，鉑類藥物的作用機(jī)制主要是與DNA上的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶結(jié)合形成Pt-DNA加合物，導(dǎo)致DNA的鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián)，引起DNA復(fù)制障礙，從而抑制瘤細(xì)胞分裂［11］。但是，不同個(gè)體對(duì)鉑類藥物敏感性有很大差異，不良反應(yīng)也不相同。而吉西他濱作為一種抗代謝藥物，在進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)過(guò)代謝轉(zhuǎn)化為二氟脫氧胞嘧啶核苷酸發(fā)揮干擾DNA合成的作用，但它在脫氨酶的作用下也可轉(zhuǎn)化為二氟脫氧尿嘧啶核苷酸，抑制胸苷酸合成酶，發(fā)揮類似于5-氟尿嘧啶的抗癌作用［12］。高長(zhǎng)明等［13］在觀察MTHFR基因多態(tài)性與胃癌化療不良反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，T/T基因型患者的惡心嘔吐反應(yīng)顯著高于C/C，T/C基因型患者(P=0.002)。Toffoli等［14］在采用CMF方案進(jìn)行乳腺癌的輔助化療中發(fā)現(xiàn)，T/T表型者表現(xiàn)出明顯高的骨髓不良反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，雖未發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T各基因型與嘔吐反應(yīng)相關(guān)。但是在血液學(xué)不良反應(yīng)上，MTHFR C677T基因C/C型血小板減少發(fā)生率明顯低于T/T，T/C基因型(P=0.039)。

總之，本研究初步結(jié)果表明，MTHFR C677T基因多態(tài)性與晚期NSCLC含鉑類藥物的化療近期療效及不良反應(yīng)有關(guān)，值得進(jìn)一步擴(kuò)大患者數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。由于本研究不需要檢測(cè)癌組織中的MTHFR基因，而是直接抽取患者外周血，提取白細(xì)胞DNA，檢測(cè)患者血中的MTHFR基因型，方法簡(jiǎn)便，對(duì)于不能手術(shù)取得癌組織的患者，尤其是晚期癌癥患者具有較高的臨床價(jià)值。

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Relationship between MTHFR C677T gene polymorphisms and chemotherapy side effects in advanced non-small cell lung cancer

KOU Jun-yan1, HONG Wei2, HONG Dan2, SU Dan3, LOU Guangyuan2, ZHANG Yi-ping2(1.Department of Synthetical Oncology, Hangzhou Cancer Hospital, Hangzhou Zhejiang 310002, China; 2.Department of Chemotherapy, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou Zhejiang 310002, China; 3.Cancer Research Institution, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou Zhejiang 310022, China)

ZHANG Yi-ping E-mail: zyp@medmail.com.cn

Background and purpose:Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) plays an important role in metabolism of folate and DNA methylation. This study aimed to investigate the relationship between methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism and chemotherapy side effects in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients.Methods:A total of 100 patients with advanced NSCLC con fi rmed by pathology were included into this study in Zhejiang Cancer Hospital from Jun. 2007 to May. 2009. All patients received the combined chemotherapy of platinum drug and gemcitabine. MTHFR genotypes were determined by allele-specific-PCR technology.Results:In the 100 cases, genotype frequency of MTHFR C677T T/T, T/C and C/C were 20%, 44% and 36%, respectively. Compared with patients of T/T and T/C genotype, patients of C/C genotype were correlated with decreased rate of thrombocytopenia to chemotherapy (P=0.039). No signi fi cant differences were observed concerning gastrointestinal toxicity.Conclusion:MTHFR C677T gene polymorphism can be used to predict the adverse reactions to platinum-based chemotherapy in patients with advanced NSCLC.

Methylenetetrahydrofolate reductase; Non-small cell lung cancer; Chemotherapy; Platinum; Side effect

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.007

R734.2

A

1007-3639(2014)03-0197-06

2014-01-12

2014-02-28）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目(No：2007B025)。

張沂平 E-mail:zyp@medmail.com.cn