板藍(lán)根抗氧化成分的提取及活性分析

趙琳靜，李洪森，吳曉英，喬 妍，王 磊，林旭東，燕方龍

（上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海201620）

板藍(lán)根抗氧化成分的提取及活性分析

趙琳靜，李洪森，吳曉英，喬 妍，王 磊，林旭東，燕方龍*

（上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海201620）

采用95%乙醇提取板藍(lán)根，并用石油醚、氯仿和正丁醇依次萃取，醇提后藥渣通過水提醇沉法制備粗多糖。采用鐵氰化鉀還原反應(yīng)、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基三種抗氧化模型，比較上述極性部位的抗氧化活性，并考察抗氧化活性與總糖含量的關(guān)系。結(jié)果表明，板藍(lán)根不同極性部位的抗氧化活性差異較大，與總糖含量相關(guān)性較小。其中，氯仿萃取物對(duì)超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除率最高，IC50值分別為3.38、0.19mg/mL，是從板藍(lán)根中篩選非多糖類天然抗氧化劑的重要部位。醇提后藥渣通過水提醇沉法制得的粗多糖部位總糖含量最高，為18.66%。板藍(lán)根所具有的抗氧化活性可能是該藥發(fā)揮解“內(nèi)毒”作用的重要機(jī)制。

板藍(lán)根，抗氧化，多糖，還原能力，超氧陰離子自由基，DPPH自由基

板藍(lán)根（Indigowoad Root）為我國清熱解毒類代表藥物，別名藍(lán)靛根、靛青根等，是十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[1]。自由基是生物體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的“內(nèi)生毒素”，與機(jī)體許多功能障礙和疾病發(fā)生，如吞噬、中毒、炎癥、腫瘤、衰老、輻射損傷等有密切關(guān)系，由自由基所引起的疾病已多達(dá)100余種[2]。從減少自由基的堆積、抑制過氧化反應(yīng)角度研究清熱解毒類中藥的作用機(jī)制具有重要意義[3]。

多糖廣泛存在于自然界，是許多植物中草藥有效成分之一，具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等作用[4]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，板藍(lán)根多糖在體外、體內(nèi)也均顯示出較好的抗氧化作用[5-6]。但是，迄今為止，尚未見有關(guān)系統(tǒng)考察板藍(lán)根不同極性部位中多糖含量與抗氧化性能關(guān)系的報(bào)道。本研究采用95%乙醇提取板藍(lán)根，并用石油醚、氯仿和正丁醇依次萃取，醇提后藥渣通過水提醇沉法制備粗多糖。采用苯酚-硫酸法及鐵氰化鉀還原反應(yīng)、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基三種抗氧化模型，測(cè)定板藍(lán)根不同極性部位的多糖含量，研究其體外抗氧化活性，并對(duì)抗氧化活性與多糖含量的關(guān)系進(jìn)行分析，為后期進(jìn)一步開展板藍(lán)根抗氧化活性成分的篩選及機(jī)制研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板藍(lán)根飲片 購自上海余天成醫(yī)藥有限公司，40℃干燥，粉碎，過20目篩；二苯代苦味?；杂苫―PPH·） 購自Sigma-Fluka公司；無水乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、葡萄糖、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等 均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-7504紫外可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海逸龍科技有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 板藍(lán)根醇提物、各分級(jí)萃取物及總糖部位的制備[7]稱取板藍(lán)根粉末150g，加入750mL 95%乙醇水浴提取兩次，每次3h。過濾，合并濾液，減壓濃縮，40℃真空干燥，得板藍(lán)根乙醇提取物（EE），稱重并計(jì)算提取率。將所得EE分散于水中，采用系統(tǒng)溶劑萃取法分級(jí)萃取，依次得石油醚部位（PEF）、氯仿部位（CF）、正丁醇部位（BF）及剩余水層（WR）。將各部位旋轉(zhuǎn)濃縮，真空干燥，稱重并計(jì)算提取率。

稱取干燥后板藍(lán)根濾渣，加40倍體積水于80℃水浴提取1.5h，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)濃縮后加無水乙醇使含醇量達(dá)75%，4℃靜置過夜。過濾，沉淀物40℃真空干燥，得板藍(lán)根粗多糖（CPS），稱重并計(jì)算提取率。

1.2.2 總糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[8]測(cè)定不同極性部位總糖含量。以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。

總糖含量（%）=總糖質(zhì)量/提取物質(zhì)量×100

1.2.3 還原能力的測(cè)定 采用鐵氰化鉀還原法[7]進(jìn)行。2.5mL磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）中加入2.5mL供試品溶液及2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，振蕩混勻后于50℃水浴反應(yīng)20min。急速冷卻，加2.5mL 10%三氯乙酸，3000r/min離心10min。取上層清液5mL，加入5mL水和1mL 0.1%FeCl3，混勻，室溫靜置10min后于700nm測(cè)吸光度（A）。每個(gè)樣本平行處理三次。

1.2.4 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測(cè)定 通過鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生O2-·，參照文獻(xiàn)方法[9-10]并略加修改。精密移取50mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH8.20）6mL于具塞試管中，加入供試液1mL，于37℃水浴保溫10min，然后加入37℃預(yù)熱的7mmol/L鄰苯三酚1.0mL，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)4min后，迅速用0.5mL濃鹽酸終止反應(yīng)，于320nm測(cè)定吸光度（A）。以BHT和維生素C為陽性對(duì)照。每個(gè)樣本平行處理三次。按照以下公式，計(jì)算板藍(lán)根不同極性部位對(duì)體系中O2-·的清除能力。

清除率（%）=[（A空－A測(cè)）/A空]×100

式中，A空為鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率，A測(cè)為加入各極性部位后鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率。

如果O2-·清除率與樣品濃度的量效關(guān)系呈線性，則求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2，計(jì)算清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品量IC50。

1.2.5 清除DPPH自由基（DPPH·）能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。精密移取不同濃度的各供試品溶液2mL于具塞試管中，加入0.1mmol·L-1的DPPH·溶液2mL，振蕩后室溫反應(yīng)30min，于517nm測(cè)定吸光度（A）。以BHT和維生素C為陽性對(duì)照。每個(gè)樣本平行處理三次。按照以下公式，計(jì)算板藍(lán)根不同極性部位對(duì)DPPH·的清除能力。

清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100

式中，A1為2mL DPPH·溶液與2mL樣品液混合后測(cè)得的吸光度；A2為2mL樣品液與2mL無水乙醇混合后測(cè)得的吸光度；A0為2mL DPPH·溶液與2mL無水乙醇混合后測(cè)得的吸光度。

如果DPPH·清除率與樣品濃度的量效關(guān)系呈線性，則求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2，計(jì)算清除率達(dá)50%時(shí)所需的樣品量IC50。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，以p＜0.05為差異顯著。文中所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按1.2.2項(xiàng)下方法，以吸光度A為縱坐標(biāo)、濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 0.054X+0.017，R2=0.098。結(jié)果表明，無水葡萄糖在5～40μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 板藍(lán)根不同極性部位的提取率和總糖含量

板藍(lán)根乙醇總提物EE經(jīng)液-液萃取得到的4個(gè)萃取部位的提取率順序?yàn)閃R＞BF＞PEF＞CF，醇提后藥渣經(jīng)水提醇沉法得到的CPS提取率為13.42%。根據(jù)回歸方程計(jì)算各部位中總多糖含量（表1）。結(jié)果表明，板藍(lán)根乙醇提取物EE中總糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于藥渣經(jīng)水提醇沉獲得的CPS中總糖含量。醇提物四個(gè)分級(jí)萃取產(chǎn)物（PEF、CF、BF和WR）的總糖含量隨提取溶劑極性增加而增大，與多糖極性大、難溶于脂溶性有機(jī)溶劑有關(guān)。

表1 板藍(lán)根不同極性部位的提取率和總糖含量Table 1 Yields and total sugar contents of different polar fraction from Indigowoad Root

2.3 板藍(lán)根不同極性部位的還原能力測(cè)定

還原能力反映了物質(zhì)的供電子能力，是評(píng)價(jià)物質(zhì)體外抗氧化活性常用的指標(biāo)，可間接反映抗氧化活性的強(qiáng)弱。鐵氰化鉀還原法的原理是，具有還原能力的物質(zhì)可使鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀在酸性條件下與Fe3+絡(luò)合形成普魯士藍(lán)，在700nm處有最大吸收。因此，吸光度越大，表示樣品的還原能力越強(qiáng)。

K3Fe（CN）6+樣品→K4Fe（CN）6+樣品氧化物

K4Fe（CN）6+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

由圖1可知，各供試液濃度與還原能力呈正相關(guān)，隨著樣品濃度增大，還原能力不斷增強(qiáng)。相同濃度時(shí)，CF的還原能力明顯高于CPS及其他極性部位，還原能力順序?yàn)椋篊F＞CPS＞EE＞W(wǎng)R＞PEF＞BF。

圖1 板藍(lán)根不同極性部位的還原能力（n=3）Fig.1 Reducing power of different polar fraction from Indigowoad Root（n=3）

2.4 板藍(lán)根不同極性部位對(duì)O2-·的清除能力

O2-·為體內(nèi)壽命最長的自由基，通常作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，生成活性更強(qiáng)的·OH，造成機(jī)體進(jìn)一步氧化損傷。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，釋放O2-·，并形成一系列有色中間產(chǎn)物?？寡趸瘎┑募尤肟梢种圃撗趸^程，減少有色物生成，使吸光度減小。由圖2可知，板藍(lán)根不同極性部位對(duì)O2-·的清除能力明顯低于陽性對(duì)照BHT和維生素C。相同濃度時(shí)，CF對(duì)O2-·的清除能力明顯高于CPS及其他極性萃取部位，計(jì)算得IC50為3.38mg/mL。各極性部位清除率大小順序?yàn)镃F＞CPS＞BF＞EE＞W(wǎng)R＞PEF。

圖2 板藍(lán)根不同極性部位對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力（%）（n=3）Fig.2 Scavenging superoxide free radical activities of different polar fraction from Indigowoad Root（%）（n=3）

2.5 板藍(lán)根不同極性部位對(duì)DPPH·的清除能力

DPPH法是清除自由基能力測(cè)定的常用方法之一，廣泛應(yīng)用于各種天然提取物體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)。DPPH·是一種穩(wěn)定的、在醇溶液呈紫色的自由基，在517nm處有強(qiáng)吸收?？寡趸瘎┛墒蛊湓谠摬ㄩL處吸收減弱，且吸光度減小程度與自由基被清除程度呈線性關(guān)系。由圖3可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，板藍(lán)根6個(gè)極性萃取部位對(duì)DPPH·的清除能力明顯高于對(duì)O2-·的清除能力，清除率大小順序?yàn)镃F＞BF＞EE＞CPS＞PEF＞W(wǎng)R。其中，CF和BF的清除能力高于其他部位，當(dāng)濃度達(dá)到1.25mg/mL時(shí)，CF和BF的清除能力分別為89.34%和85.91%，接近陽性對(duì)照BHT和維生素C；IC50分別為0.19、0.62mg/mL。

圖3 板藍(lán)根不同極性部位對(duì)DPPH自由基的清除能力（%）（n=3）Fig.3 Scavenging DPPH free radical activities of different polar fraction from Indigowoad Root（%）（n=3）

2.6 相關(guān)性分析

板藍(lán)根不同極性部位在三個(gè)抗氧化模型上表現(xiàn)出的活性與總糖含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)分別為：還原能力，r=0.004；O2-·清除率，r=0.248；DPPH·清除率，r=-0.444，且均無顯著性差異。可見，板藍(lán)根不同極性部位的抗氧化性與總糖含量相關(guān)性較小。

3 結(jié)論

板藍(lán)根不同極性部位的抗氧化活性有較大差異，與總糖含量相關(guān)性較小。氯仿萃取部位表現(xiàn)出優(yōu)于粗多糖及其他極性部位的還原能力和清除超氧陰離子自由基及DPPH自由基的能力，值得引起對(duì)板藍(lán)根脂溶性抗氧化活性成分的進(jìn)一步研究的關(guān)注。目前，板藍(lán)根抗氧化活性成分的研究多集中在多糖部位，本實(shí)驗(yàn)所采用的系統(tǒng)比較研究策略為從板藍(lán)根中篩選作用更強(qiáng)的天然抗氧化劑，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Extraction of antioxidant components from Indigowoad Root and evaluation their antioxidation in vitro

ZHAO Lin-jing，LI Hong-sen，WU Xiao-ying，QIAO Yan，WANG Lei，LIN Xu-dong，YAN Fang-long*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanghai University of Engineering Science，Shanghai 201620，China）

Indigowoad Root was extracted with 95%ethanol，and then the extract was partitioned with petroleum ether，chloroform and n-butanol successively.The crude polysaccharides was obtained from water extract and ethanol precipitate.The antioxidation of different end extracts were studied by potassium ferricyanide reduction assay，superoxide anion free radical scavenging assay and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy1（DPPH）radical scavenging assay.The relationship between the antioxidant activity and the content of total sugar was analysed.The results showed that the antioxidant activities had great difference in six polar extracts from Indigowoad Root，and the content of total sugar had low correlation with the activities.The chloroform extract showed that the highest radical scavenging rate on superoxide anion free radical and DPPH free radical，and the IC50were 3.38mg/mL and 0.19mg/mL，respectively.The chloroform extract was identified as an important fraction for further screening antioxidant components except polysaccharides.The highest content of total sugar came from crude polysaccharides extract and the content was 18.66%.The antioxidation could be one of the mechanisms in detoxication of Indigowoad Root.

Indigowoad Root；antioxidation；polysaccharides；reducing power；superoxide anion free radical；DPPH free radical

TS255.1

A

1002-0306（2014）10-0195-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.035

2013－10－09 *通訊聯(lián)系人

趙琳靜（1979-），女，博士在讀，講師，研究方向：天然產(chǎn)物提取與活性研究。

上海高校教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（B8938-11-0545）；上海市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（cs1204006）。