不同地域黃酒中酸類物質(zhì)差異性研究

王培璇，毛 健，3，*，李曉鐘，劉蕓雅，3，孟祥勇，3

（1.江南大學(xué)，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000）

不同地域黃酒中酸類物質(zhì)差異性研究

王培璇1，2，毛 健1，2，3，*，李曉鐘1，*，劉蕓雅1，2，3，孟祥勇1，2，3

（1.江南大學(xué)，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000）

通過高效液相色譜、氣相色譜法分別測定了全國不同地區(qū)的12種黃酒中的有機(jī)酸和游離脂肪酸含量，并以9種有機(jī)酸和5種游離脂肪酸為變量進(jìn)行主成分分析。結(jié)果表明：黃酒有機(jī)酸中乳酸、乙酸和檸檬酸的含量最高，占總有機(jī)酸的80%以上；前4個主成分能代表12種樣品中有機(jī)酸含量85.276%的信息，因子得分真實地反映了樣品的產(chǎn)地、原料、工藝與有機(jī)酸的關(guān)聯(lián)性。黃酒中游離脂肪酸種類豐富而且總量差異大，第一主成分、第二主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)61.783%、83.822%，能夠較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息，第一主成分包含C18∶0、C16∶0，第二主成分包含C14∶0、C18∶1，這4種物質(zhì)對黃酒整體風(fēng)味的作用可分為三種，即C18∶0和C16∶0、C14∶0、C18∶1。

黃酒，有機(jī)酸，游離脂肪酸，主成分分析

黃酒是用稻米或黍米為原料，經(jīng)蒸煮、加曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的釀造酒[1]，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大古酒[2]。酸是黃酒中重要的呈味物質(zhì)，適量的酸在酒中起到調(diào)和風(fēng)味的作用，并在貯存過程中逐步形成芳香酯[3]。黃酒中的酸類物質(zhì)包括有機(jī)酸和游離脂肪酸。有機(jī)酸是酒中酸味的主要成分，分為揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸[4]。乙酸、甲酸、丁酸等揮發(fā)酸對黃酒的感官特性具有較大的影響；乳酸、琥珀酸、檸檬酸等不揮發(fā)酸的存在能增加酒的醇厚感。此外有機(jī)酸在改善腸道功能、抗疲勞等方面具有重要意義[5]。黃酒中游離脂肪酸的研究鮮有報道，吳春等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃酒中主要含軟脂酸和硬脂酸。雖然游離脂肪酸產(chǎn)生令人不愉快的口感[7]，但由于黃酒是含有多種物質(zhì)的復(fù)雜體系，較多的游離脂肪酸會使黃酒的口感更加復(fù)雜、厚實。

由于其釀造工藝、原料、地理環(huán)境等的不同，酸類物質(zhì)的組成及含量存在較大的差異，如何建立起一種有效的方法將不同地域的黃酒進(jìn)行分類已勢在必行。主成分分析法是將眾多相關(guān)的信息進(jìn)行合并，將原始的多個指標(biāo)轉(zhuǎn)換為較少的幾個綜合指標(biāo)，盡可能多的反映原始信息[8]。目前該法已廣泛應(yīng)用于麥曲[9]、白酒[10]、蘋果酒[11]、羊羔肉[12]、饅頭[13]等風(fēng)味物質(zhì)的研究。

本文采用HPLC、GC技術(shù)對12種不同地域黃酒的有機(jī)酸、游離脂肪酸進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行主成分分析，合理解釋了這些酸類化合物與各個地域黃酒的相關(guān)關(guān)系，以期為不同地域黃酒的道地性研究提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

表1 不同地域來源的12種黃酒信息表Table 1 The introduction of 12 kinds of Chinese rice wine from different areas

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗材料 以從市場購得的12種來自不同地域的典型黃酒作為實驗樣品，樣品產(chǎn)地、原料等信息見表1；KH2PO4、無水硫酸鈉、二氯甲烷、正己烷、Na2CO3、NaCl 分析純；甲醇 色譜純；草酸、乙酸、丙酮酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、肉豆蔻酸（C14∶0）、軟脂酸（C16∶0）、十七酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、十八碳一烯酸（C18∶1） 色譜純。

電子天平 Mettler Toledo儀器（上海）有限公司；pH計 METTLERTOLEDO公司；Centrufuge 5415R型高速冷凍離心機(jī)、429665A型移液槍 德國eppendorf公司；Agilent1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；QSC-12T型水浴氮吹儀 上海泉島科貿(mào)有限公司；SHZ-C型往復(fù)水浴振蕩器 上海百典儀器設(shè)備有限公司；GC-2010型Plus氣相色譜儀 日本SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酒中有機(jī)酸的測定

1.2.1.1 黃酒樣品預(yù)處理 取5mL的黃酒發(fā)酵液于離心管中，在10000r/min的條件下離心10min后，取出上清液，并通過0.45μm的微孔濾膜過濾后直接取液進(jìn)樣。

1.2.1.2 色譜條件 高效液相色譜儀：Agilent1100（帶全自動進(jìn)樣）；色譜柱：ODSHYPERSIL（250mm× 4.6mm，5μm）；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：210nm；流動相：0.01mol/L KH2PO4水溶液（pH2.3）；流速：0.8mL/min；柱溫：30℃。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取上述有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成以下濃度：草酸：0.899mg/mL；乙酸：2.183mg/mL；丙酮酸：2.230mg/mL；乳酸：2.073mg/mL；檸檬酸：1.800mg/mL；富馬酸：0.251mg/mL；琥珀酸：1.640mg/mL；蘋果酸：1.557mg/mL；酒石酸：1.078mg/mL。

1.2.1.4 定量計算 以保留時間和樣品加標(biāo)定性，將各種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同樣的色譜條件下分開進(jìn)樣，采用峰面積外標(biāo)法定量。

1.2.2 黃酒中游離脂肪酸的測定 黃酒樣品中游離脂肪酸的測定參考吳春的方法[6]，并略有改動，具體如下：

1.2.2.1 樣品預(yù)處理 取10mL黃酒樣，加入2g NaCl，2mL濃HCl，依次用4、3、3mL正己烷∶CH2C12（V/V，2∶1）溶液連續(xù)萃取3次，有機(jī)相再用4、3、3mL 50g/L Na2CO3溶液連續(xù)萃取3次。水相用5mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至2.0后，依次用4、3、3mL正己烷∶CH2C12（V/V，2∶1）溶液連續(xù)萃取3次，收集有機(jī)相。再用N2吹到約1mL，加入3% H2SO4甲醇溶液2mL，60℃水浴酯化30min，冷卻后加入2mL正已烷，振搖，加入2mL飽和NaCl溶液振搖，離心取上層有機(jī)相于一只干燥試管中，再加入少量無水硫酸鈉以除去微量的水，正己烷定容至5mL。

1.2.2.2 色譜條件 氣相色譜儀：日本島津GC-2010；色譜柱：CP-Wax（30m×0.32mm，0.25μm）；檢測器：FID；汽化室溫度：250℃；檢測器溫度：250℃；柱溫程序：起始溫度100℃，保留3min，10℃/min至180℃，3℃/min至240℃（9min）；載氣：N2，流量3.0mL/min；燃?xì)猓篐2，流量47mL/min；助燃?xì)猓嚎諝?，流?00mL/min；進(jìn)樣量：0.5μL。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取肉豆蔻酸（C14∶0）、十七酸（C17∶0）、軟脂酸（C16∶0）、硬脂酸（C18∶0）、十八碳一烯酸（C18∶1）各800.0mg于20mL具塞試管中，加入3% H2SO4甲醇溶液2mL，60℃水浴酯化30min，冷卻后轉(zhuǎn)入10mL分液漏斗，加入2mL正已烷，加入2mL飽和NaCl溶液振搖，靜置分層后收集有機(jī)相于50mL容量瓶，水相連續(xù)用4mL正己烷萃取2次，收集有機(jī)相并入50mL容量瓶，正己烷稀釋至刻度即為標(biāo)液貯備液。將標(biāo)液貯備液稀釋50倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣。

表2 黃酒樣品中有機(jī)酸含量（μg/mL）Table 2 Organic acid concentration in Chinese rice wines（μg/mL）

1.2.2.4 定量計算 以保留時間和樣品加標(biāo)定性，將各種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在同樣的色譜條件下分開進(jìn)樣，采用峰面積外標(biāo)法定量。

1.2.3 主成分分析 本文以9種有機(jī)酸和5種游離脂肪酸作為變量，12種樣品作為考察對象，采用統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒中有機(jī)酸定量分析

2.1.1 12種黃酒樣的有機(jī)酸含量分析 采用HPLC對不同地域的12種黃酒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行分析，并根據(jù)外標(biāo)法進(jìn)行定量計算，結(jié)果如表2所示。圖1為黃酒樣品中有機(jī)酸含量分析的典型HPLC圖譜（樣4）。從表2的結(jié)果可以看出，不同地域的黃酒樣品中有機(jī)酸種類豐富，有機(jī)酸總量差異較大（4901.8～30274.4μg/mL）。其中乙酸、乳酸、檸檬酸在所有的樣品中均含有且含量最高，占樣品總有機(jī)酸含量的80%以上[14]，構(gòu)成樣品主體有機(jī)酸，丙酮酸和富馬酸的含量最低，表明它們在微生物代謝途徑中不易大量積累。

圖1 樣4有機(jī)酸含量分析的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid in sample 4

2.1.2 黃酒樣品中有機(jī)酸的主成分分析 由相關(guān)矩陣出發(fā)，計算相關(guān)矩陣的特征值和特征向量，得到特征值和貢獻(xiàn)率（表3）。前4個主成分累計得分為85.276%（＞80%），故前4個主成分能代表12種樣品中有機(jī)酸含量85.276%的信息。

表3 解釋的總方差Table 3 The exploratory factor analysis

選取前4個主成分來表示原始有機(jī)酸在樣品中的主要信息，構(gòu)建主因子模型：

F1=0.179X1-0.125X2+0.212X3+0.039X4+0.050X5+ 0.142X6+0.151X7+0.273X8+0.274X9

F2=-0.147X1-0.047X2-0.214X3+0.471X4-0.042X5+ 0.447X6-0.228X7-0.027X8+0.103X9

F3=-0.040X1+0.676X2-0.033X3+0.263X4-0.094X5+ 0.003X6+0.497X7+0.026X8+0.038X9

F4=-0.426X1+0.069X2+0.134X3+0.105X4+0.794X5-0.138X6-0.033X7+0.050X8+0.085X9

其中，變量1～9分別為草酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、丙酮酸、乳酸、富馬酸、乙酸。從以上模型看出，第1主因子F1在變量檸檬酸、富馬酸、乙酸有較高的載荷系數(shù)，則說明變量檸檬酸、富馬酸、乙酸與第1主因子F1有高的相關(guān)；第2主因子F2在變量蘋果酸、丙酮酸有較高的載荷系數(shù)，則說明變量蘋果酸、丙酮酸與第2主因子F2有高的相關(guān)；第3主因子F3在變量酒石酸、乳酸有較高的載荷系數(shù)，則說明變量酒石酸、乳酸與第3主因子F3有高的相關(guān)；第4主因子F4在變量草酸、琥珀酸有較高的載荷系數(shù)，則說明變量草酸、琥珀酸與第4主因子F4有高的相關(guān)。

通過對12種樣品中的9種有機(jī)酸進(jìn)行主成分分析，計算各個因子得分，對樣品進(jìn)行綜合評價，結(jié)果如圖2所示。

圖2 12種樣品中有機(jī)酸主成分分析Fig.2 The principal component analysis of organic acids in 12 kinds samples

從圖2可以看出，12種樣品可以被分為幾個區(qū)域，結(jié)合表1可知，#3和#4樣品所在的區(qū)域代表的產(chǎn)地為浙江紹興；#5、#6和#11樣品所在的區(qū)域代表的產(chǎn)地為江蘇、上海和安徽；#7和#12樣品所在的區(qū)域代表的產(chǎn)地為山東和遼寧。通過圖2中（a）和（b）的對比分析，#3和#4樣品主要與乳酸、草酸和檸檬酸相關(guān)聯(lián)，這表明乳酸、草酸和檸檬酸3種化合物可以將#3和#4樣品同其他地域的樣品有效地區(qū)分開。乳酸具有微弱的香氣，其酸味柔和且濃厚[15]，檸檬酸具有爽口的酸味。這兩種有機(jī)酸使紹興地區(qū)黃酒酸味較重，口感醇厚。黃酒中的有機(jī)酸部分由酒母或人工調(diào)節(jié)酸度時帶入，而大部分是在黃酒發(fā)酵的過程中由微生物代謝作用產(chǎn)生，麥曲微生物參與發(fā)酵能大幅度增加醪液中有機(jī)酸的含量。紹興地區(qū)釀造黃酒生麥曲添加量最多，其中所含霉菌、細(xì)菌等也最為豐富，因此該地區(qū)釀造的黃酒口味最為厚重。#5、#6和#11樣品主要與乙酸和富馬酸相關(guān)聯(lián)，這表明乙酸和富馬酸兩種化合物可以將#5、#6和#11樣品同其他地域的樣品有效地區(qū)分開。乙酸是一種揮發(fā)性的有機(jī)酸，少量則帶有愉快的酸香味，過量的乙酸會引起黃酒的后苦和口硬感覺等。江蘇、上海和安徽地區(qū)黃酒較紹興地區(qū)，口味偏向清爽，乙酸主要由乳酸菌產(chǎn)生。富馬酸在黃酒中普遍含量較少，但卻是一種重要的呈味物質(zhì)，富馬酸的形成離不開麥曲中的微生物參與發(fā)酵，一般霉菌、酵母、細(xì)菌會產(chǎn)生富馬酸，尤其是根霉菌對產(chǎn)富馬酸能力特別突出[16]，可能這三個地區(qū)使用麥曲中根霉菌在整個微生物群中所占比例較大。#7和#12樣品主要與蘋果酸相關(guān)聯(lián)，這表明蘋果酸和可以將#7和#12樣品同其他地域的樣品有效地區(qū)分開。從表1可知，#7和#12樣品所代表的山東省和遼寧省均為北方地區(qū)，所用黃酒原料黍米不同于江浙一帶，這可能是北方黃酒特征有機(jī)酸不同于其他地區(qū)的原因之一。

2.2 黃酒中游離脂肪酸定量分析

由圖3可以看出，不同地域黃酒中基本上均含有肉豆蔻酸（C14∶0）、軟脂酸（C16∶0）、十七酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、十八碳一烯酸（C18∶1）5種脂肪酸，但每種黃酒中游離脂肪酸的總量差異較大。為了能夠選擇有代表性的成分作為反映不同地區(qū)黃酒整體風(fēng)味的指標(biāo)，將圖3中的5類物質(zhì)做了主成分分析。

圖3 黃酒樣品中游離脂肪酸含量Fig.3 Free fatty acids concentration in Chinese rice wines

表4 解釋的總方差Table 4 The exploratory factor analysis

圖4 主成分分析碎石圖Fig.4 The principal component analysis scree plot

由表4和圖4可知，第一主成分和第二主成分的特征值依次為3.089、1.102，其累積貢獻(xiàn)率達(dá)61.783%、83.822%，能夠較好地代表原始數(shù)據(jù)所反映的信息，故提取這2個因子來反映不同地域黃酒中游離脂肪酸的原始信息。

從各變量成分得分系數(shù)矩陣（表5）可知，第1主因子在變量C16∶0、C18∶0有較高的載荷系數(shù)，則說明變量C16∶0、C18∶0與第1主因子有高的相關(guān)性；第2主因子在變量C14∶0、C18∶1有較高的載荷系數(shù)，則說明變量C14∶0、C18∶1與第2主因子有高的相關(guān)。另外，從成分1和成分2的二維投影圖（圖5）看出，成分2中C14∶0和C18∶1分別聚為一簇，說明這兩種游離脂肪酸對黃酒整體風(fēng)味產(chǎn)生不同的作用。

表5 各變量成分得分系數(shù)矩陣Table 5 The component score coefficient matrix

圖5 第一、第二主成分得分投影圖Fig.5 Principal component scores of projection

3 結(jié)論

采用HPLC對12種不同地域黃酒進(jìn)行有機(jī)酸分析，從分析結(jié)果來看，12種黃酒中有機(jī)酸的種類都比較豐富，其中乳酸、乙酸和檸檬酸的含量占到樣品總有機(jī)酸的80%以上，構(gòu)成樣品主體有機(jī)酸，這與Cao Yu等[17]的報道一致。通過對樣品中有機(jī)酸含量進(jìn)行主成分分析，可以選取4個主成分表示原始有機(jī)酸含量在樣品中的85.276%的信息。通過對主因子進(jìn)行綜合評價，可見不同地域黃酒具有不同的特征有機(jī)酸，并具有地區(qū)差異性，客觀反映了黃酒中有機(jī)酸與原料、工藝、產(chǎn)地具有一定相關(guān)性。

采用氣相色譜對12種不同地域黃酒的游離脂肪酸進(jìn)行測定，共分析了5種游離脂肪酸，不同地區(qū)黃酒中游離脂肪酸的種類均較豐富，但總量差異較大。其中C18∶0、C16∶0、C14∶0、C18∶1對黃酒風(fēng)味影響較大，而這4種物質(zhì)對黃酒整體風(fēng)味的作用可分為三種，即C18∶0和C16∶0、C14∶0、C18∶1。

[1]王家林，張穎，于秦峰.黃酒風(fēng)味物質(zhì)成分的研究進(jìn)展[J].釀酒科技，2011（8）：96-98.

[2]壽虹志，凌志勇，楊旭，等.淺析黃酒麥曲中的微生物與黃酒風(fēng)味的關(guān)系[J].中國釀造，2007（8）：55-57.

[3]李紅蕾，馮濤.不同酒齡和類型黃酒中主要味覺物質(zhì)的測定[J].中國釀造，2012，31（1）：172-175.

[4]葉芙蓉，陳細(xì)丹，倪夏紅.高效液相色譜法測定黃酒中有機(jī)酸[J].釀酒，2013，40（2）：80-85.

[5]馮愛軍，趙文紅，白衛(wèi)東，等.不同黃酒中有機(jī)酸的測定[J].中國釀造，2010（8）：144-146.

[6]吳春.古越龍山黃酒的特征風(fēng)味物質(zhì)及其成因的初步研究[D].無錫：江南大學(xué)，2009.

[7]Chen E，Jamieson A M，Vangheluwe G.Release of fatty-acids as a consequence of yeast autolysis[J].Brewers Digest，1979，54（6）：24.

[8]余寧華，陸震鳴，許偉，等.基于主成分分析的中國發(fā)酵食醋有機(jī)酸含量差異性分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（10）：144-148.

[9]Mo X，Xu Y，F(xiàn)an W.Characterization of Aroma Compounds in Chinese Rice Wine Qu by Solvent-Assisted Flavor Evaporation and Headspace Solid-Phase Microextraction[J].Journalof Agricultural and Food Chemistry，2010，58（4）：2462-2469.

[10]郭兆陽，劉明，鐘其頂，等.主成分分析OAV值評價白酒風(fēng)味組分的研究[J].食品工業(yè)，2011（7）：79-83.

[11]岳田利，彭幫柱，袁亞宏，等.基于主成分分析法的蘋果酒香氣質(zhì)量評價模型的構(gòu)建[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2007，23（6）：223-227.

[12]丁曄，劉敦華，雷建剛，等.不同處理羊羔肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的比較及主成分分析[J].食品與機(jī)械，2013，29（3）：16-33.

[13]燕雯，張正茂.不同麥胚含量饅頭香氣物質(zhì)的主成分分析[J].中國食品學(xué)報，2013，13（2）：211-215.

[14]呂旭聰，黃志清，黃若蘭，等.反相高效液相色譜法同時快速測定黃酒和葡萄酒中有機(jī)酸的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（6）：132-136.

[15]馮德明，朱長俊，王玉潔，等.黃酒發(fā)酵過程中乳酸含量分析及變化規(guī)律的研究[J].中國釀造，2009（7）：158-160.

[16]李學(xué)坤，張昆，高振，等.富馬酸的合成及應(yīng)用[J].現(xiàn)代化工，2005（S1）：81-83.

[17]Cao Y，Xie G，Wu C，et al.A Study on Characteristic Flavor Compounds in Traditional Chinese Rice Wine-Guyue Longshan Rice Wine[J].Journal of the Institute of Brewing，2010，116（2）：182-189.

Study on the difference of organic acids and free fatty acids in different Chinese rice wine

WANG Pei-xuan1，2，MAO Jian1，2，3，*，LI Xiao-zhong1，*，LIU Yun-ya1，2，3，MENG Xiang-yong1，2，3
（1.Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine，Shaoxing 312000，China）

The concentration of organic acids and free fatty acids in 12 kinds of Chinese rice wine from different areas were determined by high performance liquid chromatography（HPLC）and gas chromatography（GC）. Nine kinds of organic acids and five kinds of free fatty acids were studied further through principal component analysis（PCA）.Results showed that the content of lactic acid，acetic acid and citric acid were the most，which accounted for more than 80%of the total organic acids.First four principal components could represent 85.276%sample information.And the principal components value reflected that origin，raw materials and technology of Chinese rice wine were significantly correlation with the content of organic acids in Chinese rice wine.It was also found that there was a wide variety of free fatty acids in 12 kinds of Chinese rice wine，and the difference in the total content of free fatty acids in Chinese rice wine was significant.The accumulative contribution rate of the first principal component and the second principal component reached 61.783%and 83.822%respectively，which could indicate the original information.The first principal component comprised C18∶0and C16∶0and the second component comprised C14∶0and C18∶1.These 4 kinds of compounds which affected the overall flavor of Chinese rice wine could be divided into three types：C18∶0and C16∶0，C14∶0，C18∶1.

Chinese rice wine；organic acids；free fatty acids；PCA

TS262.4

A

1002-0306（2014）10-190-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.034

2014－02－27 *通訊聯(lián)系人

王培璇（1984-），女，博士，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。

國家863計劃項目（2013AA102203-06）。