Nodal在肝細胞癌組織的表達與意義*

王修軍 莢衛(wèi)東 許戈良 劉文斌 任維華 李建生 張傳海 馬金良 余繼海 葛勇勝

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是人類多發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率居第六位，在全球腫瘤相關(guān)死亡原因中居第三位[1]。Nodal是一個在胚胎發(fā)生中正常表達的形態(tài)發(fā)生因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor beta，TGF-β） 家族中的重要成員，在一定的情形下，它能夠誘導(dǎo)正常組織上皮細胞丟失原先存在的頂面-底面極性，變成具有間質(zhì)細胞形態(tài)和特性的細胞，失去細胞間的緊密連接和粘附連接功能，使得細胞獲得了浸潤性和游走遷移能力，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）現(xiàn)象[2，3]。因此，Nodal是引起腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)因素之一。此外，線性基因組系列分析顯示，Nodal的表達限于胚胎組織、人胚胎干細胞和癌組織細胞[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)Nodal在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、睪丸癌移植瘤和侵襲性乳腺癌細胞株中存在表達[5]。但在HCC組織中是不是也存在表達，尚未見報道。本課題對Nodal在人肝癌組織的表達及其意義進行了研究。

資料與方法

一、一般資料 選取2004年1月～2009年7月在我科行手術(shù)治療的肝癌患者95例，其中男性68例，女性27例，年齡23～81歲，平均年齡52.3±1.7歲。參考國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年第六次修訂的TNM分期標準，TNMⅠ/Ⅱ 43例，TNM Ⅲ/Ⅳ 52例；按照Edmondson分級法進行病理學(xué)分級，Ⅰ/Ⅱ 37例，Ⅲ/Ⅳ 58例。20例癌旁肝組織及12例行手術(shù)治療的門脈高壓患者肝活檢組織作對照。

二、Nodal蛋白的檢測方法 采用免疫組織化學(xué)SP二步染色法。組織切片經(jīng)60℃溫箱烤片30分鐘，二甲苯重復(fù)脫蠟后，酒精依次脫水，自來水漂洗；PAP生物筆組織圈定后，3%去離子H2O2孵育，消除內(nèi)源性過氧化物酶；枸櫞酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)。PBS沖洗后，滴加鼠抗人Nodal單克隆抗體（臺灣Abnova公司）50μL，工作液濃度為1:100。37℃孵育2h或4℃孵育過夜；滴加SP二步法通用型二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），室溫孵育后PBS沖洗，光學(xué)顯微鏡下DAB顯色，蘇木素復(fù)染，無水酒精重復(fù)脫水后二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。實驗中以PBS代替一抗，作為陰性對照。細胞質(zhì)和細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達。隨機選取10個高倍鏡（400×）視野，每個視野內(nèi)計數(shù)100個細胞，觀察鏡下陽性細胞的數(shù)目。陽性細胞＜25%為陰性，25%～75%為弱陽性，75%以上為強陽性[6～8]。

三、統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件包，率的比較采用x2檢驗和Fisher精確概率計算。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、肝組織Nodal的表達 肝組織Nodal蛋白陽性表達處可見胞質(zhì)或胞膜棕黃色。結(jié)合文獻得知[9～12]，組織呈腺樣型、梁索型排列等即為癌組織的典型特點。癌細胞間纖維組織、血管等未見表達；壞死組織和浸潤炎性細胞未見表達。以癌組織中Nodal表達最為明顯（59/95），呈強陽性反應(yīng)（＞75%），且多數(shù)陽性肝癌細胞為彌漫散在分布，少數(shù)陽性細胞聚集呈強陽性，部分癌巢中呈局灶型高表達。且癌細胞排列結(jié)構(gòu)越混亂，異型性結(jié)構(gòu)越明顯，陽性細胞便越集中、染色越深，數(shù)目越多。異型性小的細胞中Nodal蛋白表達較弱（著色區(qū)域相對較少，染色淺）。大多數(shù)癌旁組織和肝硬化組織中Nodal蛋白不表達，少數(shù)癌旁組織可見弱陽性表達，但染色淺，陽性細胞數(shù)目較少。癌旁肝組織和肝組織陽性率分別為20.0%和16.7% ，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖 1 A、B、C及表1）。

圖1 A Nodal在肝炎肝硬化組織中的陽性表達量較少，染色淺

圖1 B Nodal在癌旁肝組織中的表達 細胞質(zhì)有少量黃染，且著色較淺

圖1 C Nodal在癌組織中的表達 可見細胞質(zhì)或細胞膜大部區(qū)域黃染，且著色深，組織結(jié)構(gòu)異型性明顯

表1 各組織Nodal蛋白的表達（%）

二、肝癌組織Nodal表達與臨床病理特征間的關(guān)系 在肝癌組織中，Nodal表達主要與腫瘤的血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤的分級和分期有關(guān)，而與年齡、性別等指標無關(guān)。Nodal陽性表達的患者，腫瘤直徑大、血管侵犯率高、Edmondson分級高、pTNM分期晚（P＜0.05，表2）。

表2 肝癌組織Nodal表達與臨床和組織病理學(xué)指標之間的關(guān)系

討論

肝細胞癌是人類多發(fā)性惡性腫瘤，國內(nèi)多名專家學(xué)者已從分子蛋白水平對肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展機制展開了研究，并取得了一定的進展[13，14]。但是，由于腫瘤發(fā)生機制的復(fù)雜性，人類攻克肝細胞癌的努力仍在艱難行進中。Nodal是一種與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的蛋白[15，16]，它在惡性腫瘤中存在表達。目前，Nodal在侵襲性乳腺癌細胞株、睪丸癌移植瘤和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中的表達已相繼被報道[5，17]。然而，Nodal在肝癌中是否表達至今未見報道。我們采用的免疫組織化學(xué)染色法研究提示，Nodal蛋白在肝細胞癌中存在高表達，且癌細胞排列結(jié)構(gòu)越混亂、異型性越明顯，陽性染色越深，顯示表達越強。同時，Nodal蛋白在大多數(shù)肝硬化和癌旁組織中無表達，僅極少數(shù)組織存在弱陽性表達。因此可以推斷，Nodal在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色[9，18，19]。研究結(jié)果還表明，肝癌組織Nodal蛋白的表達主要與腫瘤的血管侵犯、腫瘤大小、腫瘤的分級和分期有關(guān)，而與年齡、性別等指標無明顯相關(guān)性。

EMT調(diào)節(jié)基因Nodal可能與肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，是表達于肝細胞癌中一個重要的新蛋白。隨著該領(lǐng)域研究的深入，Nodal可能會成為肝惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要預(yù)測指標，為臨床中制定更科學(xué)的肝細胞癌診療方案提供一定的理論支持。

（安徽省立醫(yī)院肝臟外科王偉、陳浩、盛茂林、董訓(xùn)忠、劉國巖等醫(yī)師在本課題的實施過程中給予了大量無私的幫助，在此一并致謝）

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