油橄欖酒的釀造及香氣成分分析

馬騰臻，李 潁，張 莉，張彥芳，盛文軍，祝 霞，韓舜愈*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070）

油橄欖酒的釀造及香氣成分分析

馬騰臻，李 潁，張 莉，張彥芳，盛文軍，祝 霞，韓舜愈*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070）

以制取橄欖油后的果汁為原料，通過(guò)調(diào)配、發(fā)酵等工藝制得油橄欖酒，進(jìn)行理化指標(biāo)及感官評(píng)價(jià)分析，并采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)其香氣成分，以期為油橄欖 的綜合開(kāi)發(fā)利用，進(jìn)一步提高其附加值提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：產(chǎn)品酒精體積分?jǐn)?shù)（6.42%）、總糖含量（7.84 g/L）、揮發(fā)酸含量（1.04 g/L）、總二氧化硫含量（103.05 mg/L）及干浸出物含量（27.66 g/L）等理化指標(biāo)與感官評(píng)價(jià)結(jié)果均符合GB 15037—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》規(guī)定；油橄欖酒中共鑒定出69 種香氣成分，總含量約23.44 mg/L，包括12 種醇類、25 種酯類、6 種有機(jī)酸、8 種羰基類（醛和酮）、14 種萜烯類和4 種酚類，通過(guò)香氣成分的氣味活性值初步確定主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。

油橄欖酒；香氣成分；頂空固相微萃??；氣相色譜-質(zhì)譜法

油橄欖又稱洋橄欖、齊敦果，是世界著名的油用和餐用果樹(shù)，原產(chǎn)于地中海沿岸國(guó)家，目前已有4 000多年栽培歷史。我國(guó)從1956年開(kāi)始陸續(xù)引種油橄欖，現(xiàn)種植面積約3萬(wàn)公頃，主要集中在甘肅、四川等地，其中甘肅隴南地區(qū)被認(rèn)為是中國(guó)最適合種植油橄欖的地區(qū)[1-2]。

油橄欖果實(shí)主要用于榨取橄欖油，榨油后產(chǎn)生的果渣及果汁中含有糖、脂肪酸、三萜、多酚、黃酮等諸多有效成分[3]，處理不當(dāng)既導(dǎo)致環(huán)境污染又造成資源浪費(fèi)。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了物理、化學(xué)、生物及多種方法相結(jié)合的廢料處理工藝，其中成本低、污染小的生物法應(yīng)用前景最廣[4]，如Luis等[5]研究了黑曲霉在廢棄果汁中發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的工藝；國(guó)內(nèi)研究目前主要集中在果渣有效成分的提取上[2-3]，果汁多作為廢水排放，相關(guān)研究較少。

本實(shí)驗(yàn)以甘肅隴南地區(qū)經(jīng)壓榨制取橄欖油后的果汁為原料，通過(guò)調(diào)配及酒精發(fā)酵等工藝制得油橄欖果酒，并進(jìn)行了理化指標(biāo)、感官評(píng)價(jià)及香氣成分分析，旨在為油橄欖果實(shí)的高效利用，進(jìn)一步提高其附加值提供理論依據(jù)，促進(jìn)我國(guó)油橄欖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖果汁 隴南天然居油橄欖科技開(kāi)發(fā)有限公司；正辛醇、蘆?。ň鶠樯V純） 美國(guó)Sigma公司；磷鉬鎢酸顯色劑 北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；無(wú)水乙醇、氯化鈉、偏重亞硫酸鉀、一水合沒(méi)食子酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、無(wú)水葡萄糖等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；費(fèi)林溶液、次甲基藍(lán)指示液、酚酞指示液、碘標(biāo)準(zhǔn)滴定液、淀粉指示液等按照GB/T 603—2002《化學(xué)試劑：試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備》配制。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋 金壇市恒豐儀器制造有限公司；Genesis 10s紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、265079氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TG-WAX色譜柱 美國(guó)Thermo Scientific公司；頂空固相微萃取裝置、DVB/Carboxen/PDMS（50/30 μm）萃取器 美國(guó)Surpelco公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；18100摩爾超純水機(jī) 重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；MSC-400磁力加熱攪拌器 德國(guó)Wiggen Hauser公司；手持?jǐn)?shù)顯糖度計(jì)日本Atago公司；WKM-2-3三聯(lián)微孔膜過(guò)濾器 煙臺(tái)一州科美機(jī)械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油橄欖酒的生產(chǎn)工藝

油橄欖壓榨汁→離心分離→果汁→糖酸調(diào)配→發(fā)酵→分離→澄清→膜過(guò)濾→裝瓶 ↓ ↑ ↑

橄欖油 SO2酵母活化

操作要點(diǎn)：1）調(diào)配：果汁含糖量為75.7 g/L，按照17 g/L糖→體積分?jǐn)?shù)1%酒精加白砂糖進(jìn)行調(diào)配[6]，使初始糖度為160 g/L，添加SO2抑制雜菌（120 mg/L偏重亞硫酸鉀），并用檸檬酸調(diào)整果汁pH值至4～4.5；2）酵母活化：取適量果汁水浴加熱至35 ℃后按推薦用量接入酵母，活化30 min，待果汁冷卻至室溫后加入發(fā)酵罐中；3）發(fā)酵：22 ℃發(fā)酵，每天測(cè)定發(fā)酵液溫度及糖含量（手持?jǐn)?shù)顯糖度計(jì)測(cè)定），主發(fā)酵期結(jié)束后（糖度不再明顯降低）按40 mg/L添加偏重亞硫酸鉀終止發(fā)酵；4）分離澄清：在10～15 ℃的酒窖中貯存，通過(guò)定期倒罐去除酒泥，并用40 mg/L明膠對(duì)果酒進(jìn)行澄清處理；5）過(guò)濾裝瓶：按40 mg/L添加偏重亞硫酸鉀，膜過(guò)濾機(jī)（濾膜孔徑分別為1、0.45 μm和0.22 μm）過(guò)濾后裝瓶貯存。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 常規(guī)指標(biāo)

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定酒精體積分?jǐn)?shù)（密度瓶法）、干浸出物含量、總糖含量、總酸含量（指示劑法）、揮發(fā)酸含量、總二氧化硫含量（直接碘量法）等指標(biāo)。

1.3.2.2 色度、色調(diào)

油橄欖酒于0.45 μm孔徑的濾紙過(guò)濾后測(cè)定pH值，用相同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液以1∶10（V/V）稀釋酒樣。取稀釋后的酒樣于1 cm比色杯中，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)420、520 nm和620 nm條件下分別測(cè)定其吸光度[7]。三者吸光度之和即為該酒樣色度值，前兩者比值為色調(diào)值。

1.3.2.3 總酚含量的測(cè)定

福林酚比色法[7]：吸取2.0 mL酒樣，用水稀釋至100 mL，然后吸取1.0 mL樣品溶液分別加入水5.0 mL、福林酚顯色劑1 mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%碳酸鈉溶液3 mL，顯色。放置2 h后在765 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（方程）計(jì)算出樣品中總酚的含量。

1.3.2.4 單寧含量的測(cè)定

參照NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定：分光光度法》測(cè)定。

1.3.2.5 總黃酮含量的測(cè)定

AlCl3顯色法[8]：吸取2 mL酒樣用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液稀釋至10 mL，取1 mL稀釋后的酒樣，加4 mL 體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液，搖勻，再加4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% AlCl3溶液，最后用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液稀釋至10 mL，搖勻放置10 min后在415 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定樣品吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（方程）計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。

1.3.3 感官分析

在標(biāo)準(zhǔn)葡萄酒品嘗實(shí)驗(yàn)室中，由5 位專家組成的感官分析品嘗小組參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行感官分析。

1.3.4 香氣物質(zhì)分析[9]

1.3.4.1 香氣成分的富集

在裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入5 mL油橄欖酒、1.5 g NaCl、50 μL 1-辛醇乙醇溶液（使其在最終酒樣中的質(zhì)量濃度為8.3 mg/L），在45 ℃條件下恒溫?cái)嚢?0 min后，用活化好的固相微萃取器吸附30 min，氣相色譜進(jìn)樣口解吸溫度250 ℃，解吸時(shí)間10 min，進(jìn)行分析。

1.3.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）條件

色譜柱：Thermo TG-WAX（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；升溫程序：50 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；不分流進(jìn)樣；電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～450。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性：由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)的檢索比對(duì)進(jìn)行定性，比對(duì)時(shí)要求匹配度大于800（最大值為1 000）；定量：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析，內(nèi)標(biāo)選用1-辛醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖1 總酚/單寧含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve for total phenols or tannin assay

圖2 總黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Calibration curve for total flavonoids assay

2.2 理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與分析

表1 油橄欖酒理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 1 Physical and chemical parameters of Olea europaea L. wine

由表1可知，總二氧化硫含量、總糖含量（半干酒）、酒精體積分?jǐn)?shù)、揮發(fā)酸含量及干浸出物含量等指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；總酚、單寧含量及色度值與蛇龍珠干紅葡萄酒相當(dāng)[7]。色度值可用于衡量果酒的色澤品質(zhì)，一般而言，總酚、單寧、總花色苷含量較高的果酒顏色深，色度值高，反之色度值則較低，但也受果酒SO2含量及pH值的影響。油橄欖酒中的黃酮類化合物主要有木犀草苷、蘆丁等[3,8]，總含量約為31.65 mg/L。

2.3 油橄欖酒感官分析結(jié)果

感官分析是果酒品質(zhì)檢驗(yàn)的經(jīng)典方法，具有儀器分析無(wú)法替代的作用。感官分析結(jié)果表明，該果酒呈棕紅色，澄清透明，無(wú)沉淀及懸浮物，具有純正、優(yōu)雅的果香與酒香，口感較舒順、完整，有特殊的橄欖香。

2.4 油橄欖酒香氣GC-MS定性結(jié)果

圖3 油橄欖酒香氣成分GC-MS總離子流圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of volatile compounds detected in Olea europaea L. wine

根據(jù)總離子流圖（圖3），油橄欖酒中初步鑒定出69 種香氣化合物，總含量為23.44 mg/L，其中醇類12 種、酯類25 種、有機(jī)酸6 種、羰基化合物（醛和酮）8 種、萜烯類14 種、酚類4 種，分別占總組分的27.78%、45.97%、5.80%、3.39%、8.86%和8.20%，各香氣物質(zhì)及其含量見(jiàn)表2。

香氣成分是衡量果酒風(fēng)味品質(zhì)的主要指標(biāo)，果酒的香氣來(lái)自果實(shí)本身、酵母發(fā)酵及陳釀等過(guò)程，其主要成分有酯、醇、萜烯、酚、縮醛、內(nèi)酯、脂肪酸等[16]。各組分對(duì)香氣的貢獻(xiàn)取決于它們的濃度和閾值，根據(jù)OAV值并參考文獻(xiàn)報(bào)道，油橄欖酒中OAV值大于1的化合物有23 種，初步確定主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。

2.4.1 醇類化合物

發(fā)酵階段可產(chǎn)生高級(jí)醇、酯和有機(jī)酸等主要香氣物質(zhì)，根據(jù)定性定量結(jié)果，該階段形成的香氣物質(zhì)是酒最主要的香氣成分。高級(jí)醇是酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物，其含量受發(fā)酵條件、醪液理化指標(biāo)及原料等因素的影響[13]。油橄欖酒中含量最高的醇類物質(zhì)是異戊醇，其次是苯乙醇，它們都是果酒發(fā)酵中酵母的代謝產(chǎn)物，當(dāng)其質(zhì)量濃度分別高于300 mg/L和140 mg/L時(shí)會(huì)有腐臭味，低于此值則會(huì)給酒體帶來(lái)宜人的果香和花香[17]。具有青草味和果香的1-己醇和順-3-己烯-1-醇是C6醛、醇類化合物，主要由橄欖油制取過(guò)程中多不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）在脂氧合酶作用下產(chǎn)生[18]。

2.4.2 酯類化合物

酯類的形成也受醪液理化組成及發(fā)酵條件的影響。酒精發(fā)酵階段，在酯酶催化作用下酰基CoA與乙醇合成脂肪酸乙酯，乙酰CoA和高級(jí)醇合成乙酸酯[19]。在該果

酒所檢出的69 種化合物中，酯類占25 種，是種類最多的化合物。

表2 油橄欖酒香氣成分及含量Table 2 Aroma composition of Olea europaea L. wiinnee

酯類化合物中乙酸乙酯含量最高，在較低濃度水平下，可增加酒體香氣的復(fù)雜性。具有氣味活性值的乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等低分子質(zhì)量酯類物質(zhì)由于具有水果的芳香味而常被稱為“水果”酯類[20]。

2.4.3 萜烯類化合物

萜烯類化合物屬于植物體中由乙酰CoA合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，以游離態(tài)和無(wú)味的糖苷結(jié)合態(tài)存在于植物果實(shí)中，該類化合物具有濃郁的香味，且感官閾值較低[19]，通常具有花香、果香、種子、木頭及根莖的氣味[20]。

油橄欖酒中初步鑒定出14 種萜烯類化合物，與油橄欖果實(shí)及橄欖油[18,21]中的報(bào)道相似，其中里那醇、香葉醇、異香茅醇和α-萜品醇有氣味活性值，賦予酒濃郁的花香和果香。

2.4.4 其他化合物

油橄欖酒中還檢測(cè)到了有機(jī)酸、羰基化合物和揮發(fā)性酚類物質(zhì)等。盡管產(chǎn)品中鑒定出的有機(jī)酸含量都低于閾值，但這些酸仍可為酒帶來(lái)新鮮感并同時(shí)平衡果香[13]。油橄欖酒中醛酮類化合物的種類少于果實(shí)和橄欖油[18,21]，這可能是釀造過(guò)程中的損失及轉(zhuǎn)化所致，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。α-紫羅酮和β-紫羅酮為紫羅蘭香，在酒的香氣構(gòu)成中具有重要作用；β-大馬酮表現(xiàn)為花香和果香且閾值極低（6 μg/L），對(duì)酒感官影響較大，但也有一些學(xué)者認(rèn)為其主要作用是增強(qiáng)果實(shí)中其他化合物的香氣，而非單獨(dú)呈味[13]。果酒中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)來(lái)源于果實(shí)本身或酒精發(fā)酵過(guò)程，由酚酸降解或酒香酵母產(chǎn)生[13]。該果酒初步鑒定出的4 種揮發(fā)性酚類物質(zhì)中，愈創(chuàng)木酚氣味活性值較高。

續(xù)表2

3 結(jié) 論

3.1 本實(shí)驗(yàn)以壓榨制取橄欖油后廢棄的果汁為原料，經(jīng)調(diào)配發(fā)酵制得油橄欖酒。所得產(chǎn)品酒精體積分?jǐn)?shù)（6.42%）、總糖含量（7.84 g/L）、揮發(fā)酸含量（1.04 g/L）、總二氧化硫含量（103.05 mg/L）及干浸出物含量（27.66 g/L）等理化指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；感官分析結(jié)果表明該果酒呈棕紅色，口感較舒順、完整，具有純正、優(yōu)雅的果香、酒香及特殊的橄欖香；OAV值分析結(jié)果表明油橄欖酒主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。

3.2 利用廢棄油橄欖果汁釀造果酒方法可行，該方法在繼油橄欖枝葉和果渣中有效成分的提取后進(jìn)一步完善了油橄欖綜合開(kāi)發(fā)利用體系，對(duì)拓寬油橄欖精深加工渠道提供了理論依據(jù)。但工藝條件對(duì)酒品質(zhì)的影響仍需進(jìn)一步研究。

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Volatile Compound Analysis of Olea europaea L. Wine

MA Teng-zhen, LI Ying, ZHANG Li, ZHANG Yan-fang, SHENG Wen-jun, ZHU Xia, HAN Shun-yu*
(Key Laboratory of Viticulture and Enology in Gansu Province, Research and Development Center of Wine Industry in Gansu Province, College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Olea europaea L. wine, fermented by Olea europaea L. juice (which arises from the production of olive oil and) with sugar/acid ratio, were evaluated for physicochemical parameters and sensory characteristics, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined with headspace solid-phase microextraction was used to profile the volatile compounds. The results showed that the alcohol degree (6.42%), total sugar (7.84 g/L), violate acid (1.04 g/L), total sulfur dioxide (103.05 mg/L), and dry extract (27.66 g/L) of Olea europaea L. wine measured up to the Chinese national standard GB 15037-2006 Analytical Methods of Wine and Fruit Wine. A total of 69 volatile compounds were identified and quantified to account for 23.44 mg/L, which included 12 alcohols, 25 esters, 6 acids, 8 aldehydes and ketones, 14 terpenes, and 4 phenols compounds. On the basis of odor activity values, geraniol, benzoic acid ethyl ester, octanoic acid ethyl ester, and 4-vinylguaiacol were identified as the major aroma components in Olea europaea L. wine.

Olea europaea L. wine; volatile compounds; headspace solid-phase micro-extraction; gas chromatographymass spectrometry

TS262.7

A

1002-6630（2014）18-0161-06

10.7506/spkx1002-6630-201418032

2014-01-03

馬騰臻（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槠咸丫骑L(fēng)味化學(xué)及風(fēng)味酶。E-mail：matengzhen@hotmail.com

*通信作者：韓舜愈（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸ぜ捌咸丫骑L(fēng)味化學(xué)。E-mail：gsndhsy@163.com