高效液相色譜法快速測定乳粉中的三聚氰胺與雙氰胺

楊 嘉，丁娟芳，周元元，徐 秋，朱 姜，王 帥

（1.揚州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 揚州 225111；2.揚州職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

高效液相色譜法快速測定乳粉中的三聚氰胺與雙氰胺

楊 嘉1，丁娟芳2，周元元1，徐 秋1，朱 姜1，王 帥1

（1.揚州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 揚州 225111；2.揚州職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器同時檢測乳粉中三聚氰胺和雙氰胺的分析方法。采用1%三氯乙酸溶液提取樣品中的三聚氰胺和雙氰胺，氨基柱為分析柱，流動相為乙腈-水（75∶25，V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長23 3 nm。2種物質(zhì)在0.005～60 mg/L范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好，不同添加水平的回收率在83.2%～102.6%，三 聚氰胺和雙氰胺的方法定量限分別為0.17、0.15 mg/kg，方法變異系數(shù)為2.3%～7. 2%（n=6）。此方法操作簡便、快速、成本低，適用于乳粉中三聚氰胺和雙氰胺的同時檢測。

高效液相色譜；二極管陣列檢測器；乳粉；三聚氰胺；雙氰胺

近年來，國內(nèi)外乳品質(zhì)量安全事件頻發(fā)，2008年三鹿奶粉三聚氰胺事件和2013年1月新 西蘭乳品的雙氰胺事件由于關(guān)系到未成年人這個特殊的消費群體，引起了社會各界的廣泛關(guān)注。

三聚氰胺，化學(xué)式C3H6N6，又稱蜜胺或氰尿酰胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料。部分不法分子通過向乳品中添加三聚氰胺來提高產(chǎn)品的含氮量，謀取不法利潤；一些食品包裝材料中也含有三聚氰胺，與食品接觸時會發(fā)生微量遷移[1]。雙氰胺，化學(xué)式C2H4N4，化肥工業(yè)中常用作硝化抑制劑以提高氮肥利用率和減少氮肥對環(huán)境的污染[2-3]，奶牛攝食噴灑了雙氰胺的牧草后，分泌的乳汁中會有少量殘留；與三聚氰胺一樣，雙氰胺也是成本低廉且性狀穩(wěn)定的非蛋白類高氮物質(zhì)，極有可能以較高的質(zhì)量濃度被非法添加到食品中。資料顯示，2種物質(zhì)都會對人體健康構(gòu)成已知或潛在的威脅[4-6]，不同來源的添加或帶入使得產(chǎn)品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度值可能會橫跨多個數(shù)量級，所以研究建立快速、低成本、線性范圍寬的檢測方法很有意義。

目前，三聚氰胺的檢測方法比較成熟，除常用的色譜檢測法（液相色譜法[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]等）外，還有光譜檢測法[11-12]、免疫學(xué)檢測法[13]等多種方法。食品中雙氰胺的檢測方法也有報道[14-17]，利用液相色譜-質(zhì)譜法進行檢測，雖然在分辨率和靈敏度方面有一定優(yōu)勢，但硬件配置門檻較高，推廣應(yīng)用受到一定限制。目前，食品中三聚氰胺和雙氰胺的同時檢測方法未見報道，本實驗旨在建立一種快速、有效的檢測方法，為這2 種物質(zhì)的同時測定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉 外來送檢樣品。

三聚氰胺、雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙醇、乙腈（均為色譜純）美國Tedia公司；氨水、丙酮、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、乙酸鉛、三氯乙酸（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用水符合GB/T 6682—2008《國家實驗室用水規(guī)格和試驗方法》分析實驗室一級水要求。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）美國Agilent公司；Milli-Q Academic超純水儀 美國Millipore公司；CP225D型電子天平 德國Sartorius公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；0.22 μm針式微孔濾膜過濾器 上海安譜公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：A s a h i p a k N H 2 P-5 0 4 E氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量10 ?L；流動相乙腈-水（75∶25，V/V），其中每100 mL水中添加25%氨水0.2 mL；流速1.0 mL/min；檢測波長233 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取三聚氰胺、雙氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解得到質(zhì)量 濃度均為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液（表1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

表 1 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度Table 1 Serial dilution concentrations of standard solutions of melamine and dicyandiamide

1.3.3 樣品處理

稱取2 g均勻樣品（準(zhǔn)確至0.000 1 g），置于50 mL具塞刻度試管中，加水10 mL，充分溶解后加入1%三氯乙酸溶液定容至滿刻度，劇烈振蕩5 min后靜置20 min，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，供儀器分析使用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

三聚氰胺和雙氰胺都含 有胺基，具有較強的極性，因此在傳統(tǒng)的C8和C18反相柱上不易保留，需要使用離子對試劑，后者也是藥物分析中檢測雙氰胺的常用方法[18]。利用C18柱配合離子對試劑對目標(biāo)成分進行色譜條件的優(yōu)化，但由于食品基體成分的復(fù)雜性，目標(biāo)物的同時分離效果不佳。氨基柱能用于分離極性較大的物質(zhì)，根據(jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)和文獻[19-20]報道，本實驗最終選擇氨基柱作為分析色譜柱。

2.1.2 檢測波長

取質(zhì)量濃度為2.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液及待檢樣品處理液，在190～400 nm波長處進行掃描，發(fā)現(xiàn)2 種物質(zhì)在213 nm和233 nm波長處有較大的共同吸收峰（圖1）。由于甲醇和乙腈在213 nm波長附近有紫外吸收，故選擇譜圖干擾較少的233 nm作為檢測波長。

圖1 三聚氰胺和雙氰胺的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of melamine and dicyandiamide

2.1.3 流動相

圖2 混合標(biāo)樣（2.0 mg/L）（A）、添加混合標(biāo)樣的陰性樣品（1.0 mg/kg）（B）色譜圖Fig.2 Chromatograms of mixed standards (2.0 mg/L) (A) and blank sample spiked with mixed standards (1.0 mg/kg) (B)

比較了乙腈和水的不同配比，結(jié)合標(biāo)樣色譜圖峰形和樣品 處理液的分離效果（圖2），確定了最佳的流動相條件為乙腈-水（75∶25，V/V）。由于提取試劑三氯乙酸溶液顯酸性，所以在流動相中加入了少量氨水以防止氨基柱鍵合官能團的水解，延長色譜柱的使用壽命。

2.2 提取方法的優(yōu)化

根據(jù)2 種 物質(zhì)的溶解 性并參考相關(guān)文獻[21-22]，選擇了甲醇、乙 醇、乙腈、丙酮和1%三氯乙酸作為提取試劑進行定容，配合2 種沉淀方法（1.加水溶解樣品后加入1.5 mL 10%亞鐵氰化鉀和1.5 mL 20%乙酸鋅；2.加水溶解樣品后加入2 mL 20 g/L乙酸鉛）進行提取條件的篩選和優(yōu)化。實驗中樣品加標(biāo)質(zhì)量濃度為2.0 mg/kg，每組條件平行測定3次。從表2可以看出，不使用沉淀劑，直接用甲醇或1%三氯乙酸定容、振蕩提取，三聚氰胺和雙氰胺的平均回收率均能達到90%以上。用相同的實驗條件重復(fù)測定6次，進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，甲醇和三氯乙酸對雙氰胺的回收率平均值相近，且差異不顯著；而三氯乙酸對三聚氰胺的提取效果略優(yōu)于甲醇（表3）。

三氯乙酸是國際上常用的檢測蛋白含量 的預(yù)處理方法，可實現(xiàn)樣品中蛋白態(tài)氮與非蛋白態(tài)氮的分離[23]，本實驗也采用該方法對樣品進行前處理。

表 2 不同提取方法的 回收率（n =3）Table 2 The re c overies of melamine and dicyandiamide by different extraction methods (n = 3)

表 3 甲醇和1%三氯乙酸提取方法回收率（ n=6）Table 3 The recoveries of melamine and dicyandiamide using methanol or 1% trichloroacetic acid solution as the extraction solvent (n = 6)

2.3 方法線性范圍、回收率、精密度、檢出限和定量限

按1.3.2節(jié)配制混合標(biāo)準(zhǔn)使用液、按1.3.1節(jié)色譜條件進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線，在不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與峰面積值具有良好的線性關(guān)系；以基線噪聲3倍峰面積對應(yīng)的樣品檢出濃度作為檢出限，以10倍峰面積對應(yīng)的樣品檢出濃度作為定量限。準(zhǔn)確稱取陰性樣品，進行3個水平的加標(biāo)測試，每個水平測定6次，計算回收率和精密度，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，不同添加水平下，回收率和變異系數(shù)均滿足實驗室分析要求。

表 4 方法線性范圍 、回收率、精密度、檢出限和定量限（ n=6）Table 4 Linear range, recovery, repeatability, LOD and LOQ of the method ( n= 6)

我國規(guī)定了三聚氰胺在嬰兒配方食品中的限量值為1 mg/kg，其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg[24]。雙氰胺污染目前尚不具有顯著的公共衛(wèi)生意義，國家也未制定限量標(biāo)準(zhǔn)，有資料顯 示其毒性低于三聚氰胺[4]。綜合上述情況，本檢測方法的定量限完全能夠滿足日常食品檢驗的要求。

2.4 實際樣品的測定

使用本方法對外來送檢的34個乳粉樣品進行了檢測，其中有16個樣品標(biāo)稱為進口奶源。結(jié)果在其中一個進口原料乳粉中檢出雙氰胺殘留，其含量為為0.72 mg/kg，而三聚氰胺未檢出。雙氰胺陽性樣品色譜圖見圖3。

圖3 陽性樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of positive sample

3 結(jié) 論

本實驗建立了高效液相色譜法同時測定乳粉中三聚氰胺和雙氰胺質(zhì)量濃度的檢測方法，通過1%三氯乙酸溶液的提取及氨基色譜柱的分離，取得了較理想的實驗效果，方法精密度和回收率能滿足實際檢測的要求。本方法前處理簡單、操作性強，利用二極管陣列檢測器進行定性，成本低于質(zhì)譜檢測法，降低了實驗室檢測的門檻，易于推廣，適用于日常檢測中的分析定量。

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Rapid De termination of Melamine and Dicyandiamide in Milk Powder by High Performance Liquid Chromatography

YANG Jia1, DIN G Juan-fang2, ZHOU Yuan-yuan1, XU Qiu1, ZHU Jiang1, WANG Shuai1
(1. Yangzhou Products Quality Supervision and Inspection Institute, Yangzhou 225111, China; 2. College of Biological and Chemical Engineering, Ya ngzhou Polytechnic College, Ya ngzhou 225009, China)

A high performance liquid chromatography-diode array detector (DAD) method was developed for rapid and simultaneous determination of melamine and dicyandiamide in milk powder. Melamine and dicyandiamide were extracted with 1% trichloroacetic acid solution. The chromatographic separation was performed on an amino column using acetonitrile-water (75:25, V/V) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min, and the analytes were detected with a DAD detector at 233 nm. Th e t wo compounds were well separated with a good linear relationship in the wide range of 0.005–60 mg/L. The av erage recoveries in milk powder were in the range of 83.2%–102.6% at several spiked levels. The lowest limits of quantification for melamine and dicyandiamide were 0.17 and 0.15 mg/kg, respectively, and the precision of the method expressed as coe fficient of variance (CV) was in the range of 2.3%–7.2% (n = 6). This method is simple, rapid, low-cost and suitable for the simultaneous determination of melamine and dicyandiamide in milk po wder.

high performance liquid chromatography; diode array detector; milk powder; melamine; dicyandiamide

TS207.3

A

1002-6630（2014）06-0172-04

10.7506/spkx1002-6630-201406037

2013-07-03

楊嘉（1982—），男，工程師，碩士，研究方向為食品檢驗技術(shù)。E-mail：jiajia82112001@163.com