蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物安全性評價初步研究

石 敏，汪何雅，成玉梁，錢 和

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物安全性評價初步研究

石 敏，汪何雅，成玉梁，錢 和*

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

通過比較蒸汽爆破預(yù)處理前后靈芝制取的靈芝粗提物中功能性成分的提取率變化來反映蒸汽爆破技術(shù)對靈芝提取過程的影響，并對靈芝提取物進(jìn)行安全性評價初步研究。以靈芝多糖，靈芝三萜提取率的變化來反映蒸汽爆破技術(shù)對靈芝粗提物的影響，采用急性毒性實驗，30d飼養(yǎng)實驗進(jìn)行安全性初步評價。結(jié)果表明：1.5MPa，150s靈芝蒸汽爆處理后的多糖提取率是3h未處理組的10倍，蒸汽爆破2.1MPa，210s處理后靈芝粗提物中三萜的提取率增加為原來的1.95倍，本次實驗初步評估表明蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物無明顯的毒副作用及不良反應(yīng)。

蒸汽爆破，靈芝多糖，靈芝三萜，毒理學(xué)

靈芝（Ganoderma Lucidum），屬于多孔菌科靈芝屬，是中醫(yī)藥寶庫中的珍品，有“仙草”、“瑞草”之稱[1]。靈芝含有對人體有益的17種氨基酸以及靈芝多糖、三萜類、生物堿、核苷類、甾醇類等有效成分，具有廣泛的藥理作用，如：抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血壓等作用，可用于防治冠心病、慢性支氣管炎、神經(jīng)衰弱、肝炎、白細(xì)胞減少，延緩衰老等[2]。

靈芝有效成分的提取方法有熱水浸提法、溶劑浸提法、酶解法[3]，但其具有提取時間長，提取率低等局限性。蒸汽爆破是近年發(fā)展起來的一種經(jīng)濟(jì)且對環(huán)境友好的處理技術(shù)，該技術(shù)的原理是利用高溫飽和蒸汽快速滲透到植物細(xì)胞組織中，并通過瞬間泄壓實現(xiàn)原料的組分分離和結(jié)構(gòu)變化，從而破壞植物的細(xì)胞組織，達(dá)到目的產(chǎn)物提取率的提高[4]。蒸汽爆破技術(shù)一般將物料放入密閉的處理罐中，在0.6～4.6MPa的壓力下維持?jǐn)?shù)秒或數(shù)分鐘之后，壓力在0.00875s內(nèi)瞬間降為大氣壓，物料溫度也在瞬間降為室溫[5]。

靈芝子實體成熟變干后為木栓質(zhì)，主要由粗大的厚壁菌絲交織排列而成，由于靈芝的功能性成分都被堅硬的細(xì)胞壁包裹，因此提取非常困難。蒸汽爆破技術(shù)通過蒸汽壓的瞬間釋放可以破壞纖維束之間的相互連接，使細(xì)胞壁破裂，因此在植物成分提取的過程中具有很好的效果，已有應(yīng)用到食品加工的報道[6]，已有的報道表明，蒸汽爆破技術(shù)主要應(yīng)用于食品加工中副產(chǎn)物的再利用，如蒸汽爆破輔助提取高溫豆粕中的蛋白質(zhì)[7]，甘蔗葉蒸汽爆破法提取木糖[8]，但至今還沒有應(yīng)用于靈芝加工過程的研究，本文研究了蒸汽爆破技術(shù)在靈芝制品加工中的應(yīng)用，同時鑒于高溫高壓的處理，初步研究了蒸汽爆破處理后靈芝粗提物的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤靈芝 福建健神生物工程有限公司；昆明小鼠，六周齡 上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國食品藥品檢定所；98%濃硫酸、苯酚、葡萄糖、乙酸乙酯、香草醛、無水乙酸、95%乙醇、高氯酸等 均為分析純。

QBS-80B型高密度蒸汽爆破機(jī) 鶴壁市正道生物能源有限公司；5804R型臺式高速冷凍離心機(jī) 德國eppendorf AG公司；AHH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器公司；Roche cobas 6000型生化分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒸汽爆破處理 將靈芝放于60℃烘箱內(nèi)烘至恒重，粉碎成邊長0.5cm左右的碎屑。取粉碎好的靈芝90g放入高密度蒸汽爆破機(jī)的處理腔中，然后通入飽和蒸汽并保壓一定時間，在極短時間內(nèi)實現(xiàn)蒸汽爆破處理，汽爆處理強(qiáng)度，分為高、中、低強(qiáng)度，高強(qiáng)度蒸汽壓為210MPa，維壓時間210s，中處理強(qiáng)度為150MPa、150s，低處理強(qiáng)度為90MPa、90s，處理后的樣品收集并保存于-20℃下，待分析。

1.2.2 靈芝多糖含量的測定 取處理過靈芝約2g（含干基1.0g），30mL蒸餾水，經(jīng)過預(yù)實驗確定于80℃水浴浸提1h，多糖即可完全浸提出來。未處理的靈芝，烘至恒重，分兩組在水浴中分別浸提1h和3h。浸提物過濾，取濾液，向濾液中加入95%的乙醇使提取液中乙醇的含量為80%，將提取液放于4℃下，靜置過夜，次日將提取液在4000r/min下離心10min，棄去上清液，取沉淀于蒸餾水中溶解成多糖溶液備用。

苯酚-硫酸法測定靈芝多糖[9]：準(zhǔn)確稱取105℃干燥恒重后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20μg，加水溶解并定容至100mL，準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，分別置于具塞刻度試管中，加水至2.0mL，滴加5%苯酚溶液1.0mL混合均勻，迅速滴加濃硫酸5.0mL，搖勻后放置5min，然后于40℃下水浴20min，取出冷卻至室溫，另外以蒸餾水2mL同上操作作為空白對照，于490nm處，測定吸光值。多糖溶液樣品按照上述方法測定，每個樣品重復(fù)三次。

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的多糖的濃度，mg/mL；n為溶液稀釋倍數(shù)；v為提取液體積，mL；m為靈芝原料的干重，g。

1.2.3 靈芝三萜類含量的測定 參考文獻(xiàn)[10]中的方法，取靈芝約8g（含干基3.0g），90mL 95%乙醇，于75℃水浴浸提1h，過濾，取濾液。精確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，溶解于50mL乙酸乙酯中，混合均勻得標(biāo)準(zhǔn)溶液（100μg/mL）吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于具塞試管中，加熱揮干溶劑，然后加入新配制的0.4mL、5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0mL高氯酸，在65℃恒溫水浴中加熱15min后冷卻至室溫，并加入5.0mL冰醋酸搖勻后置于室溫，15min后在548nm測定其吸光度，靈芝樣品按照上述方法測定，每個樣品重復(fù)三次。

式中：c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的三萜的濃度，mg/mL；n為溶液稀釋倍數(shù)；v為提取液體積，mL；m為靈芝原料的干重，g。

1.2.4 蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物的小鼠急性毒性實驗[11]取昆明小鼠20只，隨機(jī)分為2組，正常對照組和給藥組，每組10只（雌雄各半）。實驗前禁食不禁水12h，靈芝提取物為靈芝水提物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥所得的固體溶解于蒸餾水的溶液，汽爆靈芝組1次灌胃給藥劑量15g/kg，給藥濃度300mg/mL，即給藥量每10g體重給予0.5mL；共灌胃2次，間隔4h，對照組給予等量的蒸餾水。給藥后連續(xù)觀察14d，在同一條件下分籠飼養(yǎng)，普通顆粒飼料，自由飲水，室溫（22±2）℃記錄動物的活動及死亡情況。

1.2.5 30d喂養(yǎng)實驗 選健康的、六周齡的昆明小鼠80只，雌雄各半。小鼠隨機(jī)分為3個劑量組和1個陰性對照組，每組雌、雄小鼠各10只。成人（60kg）推薦量為每天3g靈芝提取精粉，按照成人用量的25、50、100倍，分高、中、低劑量組灌胃小鼠。經(jīng)口灌胃汽爆處理的靈芝提取物，陰性對照組給予蒸餾水，連續(xù)觀察30d。每天觀察并記錄動物的行為及毛色，每周稱一次體重和食物攝入量，計算食物利用率；30d后摘眼球取血、脫頸處死，對每只動物進(jìn)行臟器大體觀察，并稱量心、肝、脾及雙腎的重量，計算相對重量；同時進(jìn)行Hb、RBC、WBC計數(shù)，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽固醇（Tc）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、血糖（GLU）的測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 實驗數(shù)據(jù)用均值±SD表示，以SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因子方差分析（One．Way ANO VA），各組問比較采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒸汽爆破處理對靈芝多糖提取率的影響

蒸汽爆破處理前后的多糖提取率比較如圖1所示，樣品中的測定值均相對于干基而言。由圖1可知，蒸汽爆破處理后靈芝提取的靈芝多糖的含量明顯高于未處理組，并且隨著處理強(qiáng)度的增加，靈芝多糖的提取率先增加后降低，中等強(qiáng)度汽爆處理的靈芝多糖的提取率可以達(dá)到5.9%，而未處理a的靈芝多糖的提取率僅為0.07%，未處理b的靈芝多糖的提取率為0.56%，1.5MPa、150s靈芝汽爆處理后的多糖提取率約是未處理組b的10倍。中等強(qiáng)度汽爆處理組即使在1h的浸提條件下也比未處理組在3h的浸提條件下的靈芝多糖得率明顯提高。

靈芝子實體是由許多排列緊密、較粗的厚壁菌絲組成，菌絲交織排列形成束狀，子實體成熟后細(xì)胞壁內(nèi)滲入脂肪形成木栓質(zhì)，木栓質(zhì)的細(xì)胞不透水和空氣，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)與周圍環(huán)境隔絕而死亡，細(xì)胞壁分三層，胞間層主要由果膠組成，初生壁主要由纖維素和半纖維素組成，次生壁主要由纖維素和木質(zhì)素組成。蒸汽爆破技術(shù)中蒸汽瞬間釋放所產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力使木質(zhì)素和半纖維素對纖維素的保護(hù)作用遭到破壞，纖維間的粘結(jié)被削弱。同時，據(jù)汽爆原料熱性質(zhì)分析，三大組分熱解時，放熱溫度分別為半纖維素是180～300℃，纖維素是240～400℃，木質(zhì)素是280～350℃。本研究中蒸汽爆破處理的溫度在180～220℃范圍內(nèi)，部分半纖維素的水解使剩下的固相纖維素變得疏松多孔，纖維束相互分離，細(xì)胞壁破裂，使得包裹在纖維束或細(xì)胞內(nèi)的功能性成分被釋放，明顯降低了傳質(zhì)阻力[12-13]，提高了靈芝多糖的提取率。汽爆強(qiáng)度增大到一定值后，多糖會發(fā)生降解反應(yīng)和碳化，導(dǎo)致多糖提取率的降低。

圖1 蒸汽爆破處理前后靈芝多糖的提取率Fig.1 Extraction rates of ganoderma lucidum polysaccharide from treated and untreated samples

2.2 蒸汽爆破技術(shù)對靈芝三萜提取率的影響

圖2 蒸汽爆破處理前后靈芝三萜的提取率Fig.2 Extraction rates of ganoderma lucidum triterpene from treated and untreated samples

圖2反映了靈芝三萜提取率隨處理條件的不同而發(fā)生的變化，樣品中的測定值均相對于干基而言。由未處理a組和未處理b組比較可以看出靈芝三萜浸提1h即可提取完全，汽爆處理靈芝前后效果明顯，靈芝三萜的提取率隨汽爆強(qiáng)度的增加而增加，汽爆高強(qiáng)度處理三萜的提取率可以達(dá)到1.70%，而未處理組為0.87%，三萜的提取率增加了0.95倍。汽爆的強(qiáng)度越大，維管束等腔道組織膨脹，間隙孔洞增多增大以及細(xì)胞表皮出現(xiàn)解離斷裂的程度越大，三萜的提取率越高，同時由于三萜相對穩(wěn)定，所以三萜未隨處理強(qiáng)度的增加而降低。

2.3 急性毒性實驗（LD50）

實驗結(jié)果如表1所示。經(jīng)口給予蒸汽爆破處理靈芝的浸提物后，第1d，小鼠食量下降，第2～3d后小鼠的活動、食量皆恢復(fù)正常，與對照組比較，無明顯差異，實驗期間，小鼠存活狀態(tài)良好，均未出現(xiàn)明顯中毒癥狀。第14d結(jié)束實驗，小鼠被毛整齊有光澤，眼睛視物有神，耳鼻口外無異常分泌物，破潰，肛周無排泄物附著，解剖小鼠，胸腔、腹腔內(nèi)無積液，肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與對照組比較，皆未發(fā)現(xiàn)明顯病變和差異。由此可以認(rèn)為，汽爆處理靈芝的浸提物的LD50應(yīng)大于15g/kg，依據(jù)國家急性毒物（LD50）劑量分級標(biāo)準(zhǔn)可知汽爆處理靈芝制取的靈芝粗提物屬于無毒物[14]。

表1 蒸汽爆破處理靈芝的提取物對KM小鼠的急性毒性（LD50）實驗結(jié)果Table.1 Results of acute toxicity LD50test in mice

2.4 蒸汽爆破處理靈芝的提取物的30d喂養(yǎng)實驗

實驗結(jié)果如表2～表4所示。表2結(jié)果顯示，雄鼠的食物利用率都略高于雌鼠，但灌胃組雄鼠和雌鼠與陰性對照組相比均無顯著性差異（p＞0.05），表明蒸汽爆破處理靈芝的提取物對小鼠的食物利用率無明顯影響。

由于臟體比值在正常成年動物中變化范圍較小，臟體比系數(shù)的比較結(jié)果在毒性實驗中被看做一項重要指標(biāo)。表3為小鼠部分器官的臟體比。由表3可知，與陰性對照組相比，受試物各組動物的心、肝、脾、腎與體重的比值均在正常范圍內(nèi)，灌胃組與陰性對照組也無顯著性差異（p＞0.05），表明受試物對小鼠的內(nèi)臟器官無明顯影響。同時，病理組織學(xué)觀察[15]顯示：內(nèi)臟器官大小、色澤正常，邊緣銳利，無新生物和粘連，其他臟器亦未見異常病理變化。

表4和表5為小鼠血清生化指標(biāo)的測定結(jié)果。谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶是肝功能的敏感指標(biāo)，尿素氮可以反映腎臟的損傷，總蛋白與肝臟的合成數(shù)量和腎臟丟失量有關(guān)[15]，由表4結(jié)果可知，雌雄小鼠灌胃組與陰性對照組無顯著性差異，表明受試物對肝臟和腎臟無顯著性損傷。血糖、總膽固醇和甘油三酯與體內(nèi)代謝有關(guān)，表5的結(jié)果顯示雌性小鼠的2.5g/kg組的血糖測定和雄性小鼠的1.25g/kg組的總膽固醇測定與其相應(yīng)的陰性對照組有顯著性差異（p＜0.05），但這兩組的血糖和總膽固醇的結(jié)果在正常的范圍（血糖2.78～9.77mmol/L，總膽固醇：2.1～3.9mmol/L）之內(nèi)，且與劑量的改變沒有相應(yīng)的劑量關(guān)系，此處的差異是由個體差異造成的，其余劑量組的各項指標(biāo)與陰性對照組相比，均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（p＞0.05）。

表2 蒸汽爆破處理靈芝的提取物對30d喂養(yǎng)實驗小鼠食物利用率的影響Table.2 Effect of ganoderma lucidum extract on mice increased body weight and food utilization of 30 days feeding test

表3 汽爆處理靈芝的提取物對小鼠30d喂養(yǎng)實驗臟體比的影響Table.3 Effect of ganoderma lucidum extract on mice viscera/ body weight of 30days feeding test

表5 蒸汽爆破處理靈芝的提取物對30d喂養(yǎng)實驗小鼠生化指標(biāo)的影響ⅡTable.5 Effect of ganoderma lucidum extract on mice biochemical index of 30 days feeding testⅡ

表4 蒸汽爆破處理靈芝的提取物對30d喂養(yǎng)實驗小鼠生化指標(biāo)的影響ⅠTable.4 Effect of ganoderma lucidum extract on mice biochemical index of 30 days feeding testⅠ

表6 蒸汽爆破處理靈芝的提取物30d喂養(yǎng)實驗隊小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Table.6 Effect of ganoderma lucidum extract on mice blood index of 30 days feeding text

由表6的數(shù)據(jù)說明，雌性小鼠的淋巴細(xì)胞指標(biāo)高劑量組、中劑量組與陰性對照組有極顯著差異（p＜0.01），雄性小鼠的高劑量組與陰性對照組有顯著性差異（p＜0.05），但測定的結(jié)果均在正常范圍（54%～85%）之內(nèi)，雌性小鼠低劑量組的紅細(xì)胞測定指標(biāo)與陰性對照組有顯著性差異（p＜0.05），但雌性小鼠紅細(xì)胞數(shù)量的變化趨勢與飼喂樣品劑量大小的趨勢無相關(guān)性，且此指標(biāo)的其他組未見顯著性差異，可不考慮實驗因素所致。白細(xì)胞和血紅蛋白的測定結(jié)果未見顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

蒸汽爆破技術(shù)應(yīng)用于靈芝提取時的預(yù)處理過程時，靈芝多糖、三萜提取率明顯高于未處理組，靈芝蒸汽爆破處理（1.5MPa，150s）后提取時間1h即可將多糖完全提取出來，靈芝汽爆處理后浸提1h的多糖提取率是未處理組浸提3h后10倍，蒸汽爆破2.1MPa，210s處理后靈芝粗提物中三萜的提取率增加了0.95倍，同時對蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物進(jìn)行初步的安全性評價，經(jīng)過測定得出小鼠經(jīng)半數(shù)致死量（LD50）均大于15g/kg BW，該樣品屬無毒級；小鼠30d喂養(yǎng)實驗結(jié)果表明，與對照組比較，蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物三個劑量組除淋巴細(xì)胞在正常范圍內(nèi)略有增加，其他組的體重、食物利用率、血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟體比及高劑量組織病理學(xué)檢查均未見異常，蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物高劑量組的劑量是人體推薦量（50mg/kg BW）的100倍。本次實驗初步評估表明蒸汽爆破法預(yù)處理制取的靈芝粗提物無明顯的毒副作用及不良反應(yīng)。靈芝含有多種功能性成分，在未來的研究過程中，在對汽爆所得提取物的安全性進(jìn)行更全面評估的同時，也可著重研究靈芝汽爆處理后提取物結(jié)構(gòu)或組分的變化；靈芝提取物功能性的變化。

蒸汽爆破技術(shù)作為近年來新興的處理技術(shù)，在靈芝加工過程中對功能性成分提取率的增加，提取時間的縮短等方面均有顯著地作用，同時此方法處理時間短，耗費(fèi)能量低，僅有物理加工過程，無化學(xué)物質(zhì)的污染，蒸汽爆破處理倉為罐式，可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，在靈芝加工過程以及中草藥提取方面具有廣闊的前景。

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Studyonprimarysafetyevaluationofextractivefrom GanodermaLucidum pretreatmented by steam explosion

SHI Min，WANG He-ya，CHENG Yu-liang，QIAN He*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The effect of steam explosion on Ganoderma Lucidum extractive was evaluated by comparing the difference of functional components from treated and untreated Ganoderma Lucidum and the toxicity of extractive from Ganoderma Lucidum pretreatmented by steam explosion was evaluated.The evaluation indicators include extraction rates of Ganoderma Lucidum polysaccharide and Ganoderma Lucidum triterpene. The toxicity of Ganoderma Lucidum extract treated by steam explosion was evaluated by tests of acute toxicity and 30 days feeding test.The steam explosion for 150s at a steam pressure of 1.5MPa was effective pretreatment for the extraction of Ganoderma Lucidum polysaccharide and the polysaccharide extraction rate of treated sample was 10 times compared with the untreated sample（3h）.The steam explosion for 210s at a steam pressure of 2.1MPa was effective pretreatment for the extraction of Ganoderma Lucidum triterpene and the triterpene extraction rate of treated sample was 1.95 times compared with the untreated sample.The in vivo mouse toxicity test showed that there is no obvious toxicity of extractive from Ganoderma Lucidum pretreatmented by steam explosion.

steam explosion；Ganoderma Lucidum polysaccharide；Ganoderma Lucidum triterpene；toxicology

TS201.4

A

1002-0306（2014）06-0338-05

2013－07－19 *通訊聯(lián)系人

石敏（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制。

區(qū)域特產(chǎn)資源生態(tài)高值利用技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)（2011BAZ02169）。