裙帶菜多糖的超聲波提取及其性質(zhì)研究

程玲云，黃國(guó)清，肖軍霞

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

裙帶菜多糖的超聲波提取及其性質(zhì)研究

程玲云，黃國(guó)清，肖軍霞*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

采用超聲波法提取裙帶菜中的多糖，利用苯酚-硫酸比色法測(cè)定多糖的含量，研究了提取溫度、提取時(shí)間、料液比三個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出多糖提取的最佳工藝；同時(shí)對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究，探討了溫度、pH、硼酸和Ca2+對(duì)多糖構(gòu)象的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：裙帶菜多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1∶45（g/mL）、提取溫度80℃、提取時(shí)間40min，該條件下裙帶菜多糖的提取率達(dá)到了7.56%。超聲提取得到的裙帶菜多糖不含淀粉，但含有少量蛋白質(zhì)和硫酸基團(tuán)；溫度和硼酸對(duì)多糖的構(gòu)象沒(méi)有影響，酸和堿對(duì)多糖構(gòu)象產(chǎn)生較小影響，但Ca2+可顯著破壞多糖的構(gòu)象。

裙帶菜，多糖，超聲波提取

裙帶菜（Undaria pinnatifida），一種多年生褐藻，被稱為“海藻之王”[1]。裙帶菜含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如褐藻糖膠、褐藻酸鈉、膳食纖維等，可以預(yù)防和治療多種疾病，被譽(yù)為“海洋中的綠色蔬菜”、“餐桌上的保健食品”[2]。體內(nèi)外研究證明裙帶菜多糖有較高的抗腫瘤活性[3]，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。因此，裙帶菜多糖具有廣闊的藥用前景。

目前多糖提取純化方法和結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)有較多報(bào)道[5-6]。裙帶菜多糖（Undaria pinnatifida polysaccharides，UPPS）的提取也有了很多研究。李建等研究得到了超聲波提取法較傳統(tǒng)酸提法和堿提法得率高、損失小[7]。劉一鹿等研究了多糖提取方法并對(duì)其純度進(jìn)行鑒定為裙帶菜的推廣和普及并入治療腫瘤的藥物提供了理論基礎(chǔ)[8]。但是國(guó)內(nèi)外對(duì)裙帶菜多糖的理化性質(zhì)研究的很少。本文采用提取率較高的超聲波提取法來(lái)提取裙帶菜多糖，研究了提取時(shí)間、提取溫度和料液比對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響，并探究了pH、溫度、硼酸和Ca2+等外界因素對(duì)裙帶菜多糖溶液紫外吸光光譜的影響，以確定影響多糖構(gòu)象穩(wěn)定性的因素。本文對(duì)擴(kuò)大裙帶菜多糖的應(yīng)用范圍、促進(jìn)裙帶菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮裙帶菜 青島市城陽(yáng)區(qū)大潤(rùn)發(fā)店；苯酚（AR）、葡萄糖（AR） 天津市巴斯夫化工有限公司；硼酸（AR）、濃硫酸（GR）、鹽酸（AR） 萊陽(yáng)市康德化工有限公司；碳酸氫鈉（AR）、氫氧化鈉（AR） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；95%乙醇（AR）、丙酮（AR）、石油醚（AR） 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司。

電熱恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱 龍口市先科儀器公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平 上海奧豪斯公司；KQ-500B超聲波清洗器 江蘇省昆山市淀山湖鎮(zhèn)；UV-2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、U-V265FW紫外可見(jiàn)記錄光譜儀 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 裙帶菜多糖的提取工藝流程 新鮮裙帶菜→水洗→烘干→粉碎→超聲波提取→過(guò)濾得濾液→減壓濃縮→95%乙醇醇析→過(guò)濾→丙酮、石油醚依次洗滌→烘干→粗多糖產(chǎn)品。

1.2.2 裙帶菜多糖含量的測(cè)定（苯酚-硫酸法）

1.2.2.1 苯酚溶液的制備 取苯酚100g，加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取6g，加水溶解，定容于100mL棕色容量瓶。

1.2.2.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 取葡萄糖84.00mg定容至1000mL。將該溶液稀釋成5.25、10.50、21.00、42.00、84.00μg/mL共5個(gè)不同濃度。各吸取1.0mL置于干凈試管中，再加入苯酚2.0mL和濃硫酸5.0mL，40℃水浴30min后冷卻15min，以蒸餾水作空白，在489nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.2.3 裙帶菜多糖含量的測(cè)定 取粗多糖干品100.0mg，用去離子水定容至100mL，再吸取5.0mL定容液定容至100mL，按1.2.2.2的方法測(cè)定裙帶菜多糖含量。

1.2.2.4 裙帶菜多糖提取率的計(jì)算 裙帶菜多糖的提取率按下式計(jì)算[7]：

式中：W1：干燥的裙帶菜的質(zhì)量（g）；W2：提取粗多糖的質(zhì)量（g）；W3：用于分析測(cè)定的粗多糖質(zhì)量（g）；V：溶解W3的體積（L）；C1：多糖濃度（g/L）。

1.2.3 裙帶菜多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 提取溫度對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響 取5份裙帶菜粉分別置于500mL燒杯中，按照料液比1∶45加入去離子水，攪拌均勻于置于40kHz超聲波提取頻率中在35、50、65、80、95℃下提取20min，提取液經(jīng)紗布過(guò)濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，用95%乙醇沉淀，收集沉淀，真空干燥得到裙帶菜粗多糖，計(jì)算裙帶菜多糖含量和提取率。

1.2.3.2 料液比對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響 取5份裙帶菜粉分別置于500mL燒杯中，按料液比1∶30、1∶35、1∶40、1∶45或1∶50加入去離子水，攪拌均勻于置于超聲波頻率40kHz中于80℃下提取20min，提取液經(jīng)紗布過(guò)濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，采用95%乙醇沉淀，真空干燥得到裙帶菜粗多糖，計(jì)算裙帶菜多糖含量和提取率。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響 取5份裙帶菜粉分別置于500mL燒杯中，按料液比1∶45加入去離子水，攪拌均勻后置于超聲波頻率40kHz中于80℃下提取20、30、40、50min，提取液經(jīng)紗布過(guò)濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，采用95%乙醇沉淀，真空干燥得到裙帶菜粗多糖，計(jì)算裙帶菜多糖的含量和提取率。

1.2.4 裙帶菜多糖提取正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、浸提時(shí)間、料液比三個(gè)因素，采用L9（33）正交實(shí)驗(yàn)表[7]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交因素水平表Table.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.5 裙帶菜多糖樣品的理化性質(zhì)

1.2.5.1 外觀及溶解性 觀察所得裙帶菜粗多糖產(chǎn)品的顏色、狀態(tài)以及氣味；稱取粗糖產(chǎn)品0.1g共4份，分別放置于裝有30mL水、乙醇、丙酮、乙醚的燒杯中，放置1h，觀察是否溶解，并測(cè)定其水溶液的pH。

1.2.5.2 斐林試劑反應(yīng) 取試劑甲和試劑乙各2mL，加入裙帶菜多糖的水溶液1mL，沸水浴加熱10min，觀察有無(wú)紅色沉淀生成，以確定所得多糖是否含有還原糖[10]。

1.2.5.3 碘-碘化鉀反應(yīng) 配制2%碘化鉀溶液，然后加入適量碘。取少量多糖于點(diǎn)滴板上，加3～5滴稀碘液，觀察顏色變化，確定所得多糖是否含有淀粉。

1.2.5.4 茚三酮反應(yīng) 取裙帶菜多糖溶液1mL，加入0.5mL 0.1%茚三酮溶液，煮沸2min，冷卻后觀察溶液顏色是否呈紫色，確定所得多糖是否含有蛋白質(zhì)。

1.2.5.5 硫酸基定性檢測(cè) 取1mg裙帶菜粗多糖產(chǎn)品溶于1mL 1mol/L的鹽酸中，沸水加熱1h，之后滴加數(shù)滴氯化鋇，觀察是否有白色沉淀出現(xiàn)，確定所得多糖是否含有硫酸基[11]。

1.2.6 紫外吸收特性

1.2.6.1 裙帶菜多糖紫外吸收光譜 將裙帶菜多糖干品配成濃度為0.5mg/mL的溶液，在190～400nm范圍內(nèi)掃描[12]。

1.2.6.2 外界因素對(duì)裙帶菜多糖紫外吸收光譜的影響

1.2.6.2.1 溫度對(duì)裙帶菜多糖構(gòu)象的影響 取三份0.5mg/mL的多糖溶液分別放于20、60、100℃水浴中處理30min，冷卻至室溫，觀察裙帶菜粗多糖紫外圖譜的變化。

1.2.6.2.2 pH對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響 取三份0.5mg/mL的多糖溶液分別調(diào)至pH為3、6.5和11后觀察裙帶菜粗多糖紫外圖譜的變化。

1.2.6.2.3 Ca2+對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響 取0.5mg/mL的多糖溶液兩份，一份加入少許CaCl2，另一份作空白對(duì)照，觀察裙帶菜粗多糖紫外圖譜的變化[13]。

1.2.6.2.4 絡(luò)合物（硼酸）對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響 取0.5mg/mL的多糖溶液兩份，一份加入稍許硼酸，另一份作空白對(duì)照，觀察裙帶菜粗多糖紫外圖譜的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 裙帶菜多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響 溫度是影響多糖提取率的重要因素之一，溫度對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著提取溫度的上升，多糖提取量先增加后緩慢減少，當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，多糖的提取率最高，當(dāng)溫度繼續(xù)升高提取率開(kāi)始緩慢下降。溫度的升高可提高多糖溶解度和從裙帶菜組織中的滲出速率；但是，當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，裙帶菜組織中的部分組成成分變性凝固，從而阻止了裙帶菜多糖的滲出，因此裙帶菜多糖的提取率僅在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增加。

圖1 提取溫度對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of UPPS

2.2.2 料液比對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響 料液比也是影響裙帶菜多糖提取率的重要因素，不同料液比對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，隨著溶液量的加大，裙帶菜多糖的提取率先增大后減小，當(dāng)料液比為1∶45時(shí)達(dá)到最大值。裙帶菜干粉有較大的溶脹性，并且存在大量的膠質(zhì)物質(zhì)，只有吸收了大量的水分并充分溶脹后多糖才能從組織中滲出，因此在一定范圍內(nèi)，料液比在1∶30～1∶45時(shí)，裙帶菜多糖的提取率逐漸上升[14]。但是，當(dāng)料液比在1∶45～1∶50時(shí)，反應(yīng)體系的體積增大，超聲液功率一定的情況下裙帶帶組織受到的剪切力減少，反而使得多糖的提取率有所下降。

圖2 料液比對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響Fig.2 Effect of material/water ratio on the yield of UPPS

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響 提取時(shí)間是影響多糖提取率的一個(gè)重要因素，不同提取時(shí)間對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響如圖3所示。由圖3可以看出，提取時(shí)間在20～40min之間時(shí)，多糖的提取率變化并不大，40min時(shí)達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖的提取率反而下降。這是由于時(shí)間的延長(zhǎng)，在超聲波較強(qiáng)的機(jī)械剪切力的作用下，對(duì)多糖有一定的破壞作用[15]；同時(shí)隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，雜質(zhì)溶出率也隨之升高，這也是多糖提取率有所下降的原因之一[16]。

圖3 提取時(shí)間對(duì)裙帶菜多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction duration on the yield of UPPS

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2 Results of the orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table.3 Analysis of variance of the orthogonal experiment

2.3 裙帶菜多糖提取正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交實(shí)驗(yàn)的方差分析見(jiàn)表3。由表2極差分析可知，各因素的顯著影響順序?yàn)椋篈＞B＞C，即提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。由表3的方差分析可知，在顯著水平為0.05時(shí)提取溫度和料液比對(duì)裙帶菜多糖的提取影響顯著，提取時(shí)間對(duì)裙帶菜多糖的提取影響不顯著。因此裙帶菜多糖提取的最佳工藝條件是A2B2C3；即裙帶菜多糖提取的最佳的提取工藝條件為：料液比1∶45，提取溫度80℃，提取時(shí)間40min，在此條件下，裙帶菜多糖的提取率達(dá)到了7.56%。

2.4 裙帶菜多糖的理化性質(zhì)

2.4.1 裙帶菜粗多糖產(chǎn)品的物理性質(zhì) 裙帶菜粗多糖產(chǎn)品為淺黃褐色的粒狀固體，有些許海藻腥味；粗多糖產(chǎn)品易溶于水，但難溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑；其水溶液透明，高濃度時(shí)呈粘稠狀，其水溶液pH為6.5。

2.4.2 裙帶菜粗多糖產(chǎn)品的化學(xué)性質(zhì) 裙帶菜粗糖產(chǎn)品的斐林試劑反應(yīng)無(wú)紅色沉淀生成，表明該粗多糖為非還原性多糖；硫酸基定性實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)白色沉淀，說(shuō)明該粗多糖中有硫酸基團(tuán)；碘-碘化鉀實(shí)驗(yàn)為陰性，說(shuō)明粗多糖中無(wú)淀粉；茚三酮反應(yīng)有紫色出現(xiàn)，說(shuō)明裙帶菜粗多糖產(chǎn)品中存在蛋白質(zhì)。

2.5 裙帶菜多糖的紫外圖譜分析

2.5.1 裙帶菜多糖溶液的紫外圖譜 由圖4可以看出，裙帶菜多糖在190nm附近有明顯的吸收峰，表現(xiàn)為糖的特征吸收；在260nm處無(wú)特征吸收，說(shuō)明裙帶菜多糖不含核酸，在280nm附近有吸收峰的出現(xiàn)，說(shuō)明粗多糖中含有蛋白質(zhì)，這與茚三酮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖4 裙帶菜多糖的紫外光譜Fig.4 UV spectrum of UPPS

2.5.2 環(huán)境因素對(duì)裙帶菜構(gòu)象的影響

2.5.2.1 溫度對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響 溫度對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，不同溫度處理的裙帶菜粗多糖溶液紫外圖譜近乎完全重合，這是由于溫度沒(méi)有使多糖物質(zhì)的組成、含量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，多糖結(jié)構(gòu)的價(jià)電子沒(méi)有發(fā)生躍遷所以其紫外光譜圖沒(méi)有發(fā)生變化，因此，在20～100℃范圍之內(nèi)，溫度對(duì)裙帶菜多糖的構(gòu)象無(wú)影響。

2.5.2.2 pH對(duì)裙帶菜多糖構(gòu)象的影響 pH對(duì)裙帶菜多糖構(gòu)象的影響見(jiàn)圖6。由圖6可知，不同pH下的裙帶菜粗多糖溶液的紫外圖譜略有差異，在堿性條件下紫外光譜的吸收強(qiáng)度變大，酸性條件下紫外光譜圖吸收強(qiáng)度減小。一方面由于在酸性、中性介質(zhì)中絡(luò)合物不易形成，但隨著pH的變大，絡(luò)合物的陽(yáng)離子解離，吸光度增大。另外裙帶菜粗多糖溶液靠近中性范圍氫鍵穩(wěn)定，構(gòu)象穩(wěn)定。在較低或較高pH下，氫鍵受破壞，多糖構(gòu)象發(fā)生變化。所以酸和堿都會(huì)引起裙帶菜多糖溶液的構(gòu)象變化，但這種變化較小。

圖5 溫度對(duì)裙帶菜多糖紫外光譜的影響Fig.5 Effect of heat treatment on the UV spectrum of UPPS

圖6 pH對(duì)裙帶菜多糖紫外光譜的影響Fig.6 Effect of pH on the UV spectrum of UPPS

2.5.2.3 Ca2+對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響 Ca2+對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響見(jiàn)圖7。由圖7可知，加入CaCl2后裙帶菜多糖溶液在190～400mn的紫外吸收強(qiáng)度都明顯增加，紫外吸收略有紅移，這說(shuō)明Ca2+的加入，裙帶菜多糖構(gòu)象發(fā)生了較大的改變。推斷原因可能是由于Ca2+與兩鏈上的羧基作用引起兩鏈間的聚合，Ca2+可與含羧基的酸性多糖作用，形成“蛋箱”結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子的不對(duì)稱性增強(qiáng)[17]。

圖7 Ca2+對(duì)裙帶菜多糖紫外光譜的影響Fig.7 Effect of Ca2+on the UV spectrum of UPPS

2.5.2.4 絡(luò)合物（硼酸）對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響 硼酸對(duì)裙帶菜多糖溶液構(gòu)象的影響如圖8所示。由圖8可知，硼酸處理過(guò)的裙帶菜粗多糖溶液紫外光譜與空白組近乎完全重合，這可能是硼酸在水溶液中主要以未電離的B（OH）3形式存在，而B(niǎo)（OH）4-才是真正的絡(luò)合劑。所以加入的硼酸與裙帶菜粗多糖不能形成絡(luò)合物，即絡(luò)合劑硼酸對(duì)裙帶菜多糖的構(gòu)象不會(huì)造成影響。

圖8 硼酸對(duì)裙帶菜多糖紫外光譜的影響Fig.8 Effect of boric acid on the UV spectrum of UPPS

3 結(jié)論

本文采用超聲波提取裙帶菜多糖，其最佳提取工藝條件為：裙帶菜粉與去離子水按1∶45的液料比混合，在80℃水浴中超聲波浸提40min，多糖的提取率最高可達(dá)到7.56%。理化性質(zhì)研究結(jié)果表明，該多糖易溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑，其水溶液成弱酸性；粗多糖中含有蛋白質(zhì)，是一種含有硫酸基團(tuán)的非還原性多糖。不同溫度和硼酸處理裙帶菜多糖，其構(gòu)象幾乎不發(fā)生變化；酸堿處理對(duì)裙帶菜多糖的構(gòu)象產(chǎn)生較小的影響；Ca2+對(duì)裙帶菜多糖構(gòu)象的影響極大。

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Study on the ultrasonic-assisted extraction of polysaccharide from Undaria pinnatifida and its characterization

CHENG Ling-yun，HUANG Guo-qing，XIAO Jun-xia*
（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

In this paper，Undaria pinnatifida polysaccharides（UPPS）were extracted by ultrasonic-assisted method.The content of polysaccharides was measured by phenol-sulfate method.Effects of three factors on the extraction，including extraction temperature，extraction time and solid/solvent ratio were studied by single factor and the optimum extraction conditions were then determined through the orthogonal experiment. Meanwhile，physical and chemical properties of the resultant polysaccharide were also concerned in this paper. Results showed that these optimum extraction conditions as follows：solid/liquid ratio 1∶45（g/mL），extraction temperature 80℃，and extracting duration 40min.Under such conditions，the yield of the polysaccharide reached 7.56%.Physicochemical analysis revealed that the polysaccharide contained protein and sulfate radicals，but no starch was detected in it.The structure of the Undaria pinnatifida polysaccharides remained intact after exposure to high temperature or H3BO4.However，the polysaccharide was slightly affected by acid or alkali and the conformation of the polysaccharide was significantly damaged by Ca2+.

Undaria pinnatifida；polysaccharides；ultrasonic-assisted extraction

TS255.1

B

1002-0306（2014）06-0260-05

2013－07－22 *通訊聯(lián)系人

程玲云（1988-），女，在讀碩士研究生，主要從事功能因子穩(wěn)態(tài)化技術(shù)方面的研究。