響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇廢棄菌根的蛋白提取工藝研究

張 樂，周林燕，宋洪波，李 鵬，李亞茹，曹珍珍，魏 明，李淑榮，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇廢棄菌根的蛋白提取工藝研究

張 樂1，2，周林燕1，宋洪波2，李 鵬2，李亞茹1，曹珍珍1，魏 明1，2，李淑榮1，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

以廢棄的金針菇菌根為原料，將其制備成顆粒度為100目的粉末，以0.14mol/L NaCl溶液為提取液，采用2次提取的方法提取蛋白；在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定具有顯著影響的料液比、提取溫度、時(shí)間、pH為自變量，菌根蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和響應(yīng)面分析法，建立總蛋白提取率的二次回歸模型，確定了影響提取率的因素依次為料液比＞pH＞時(shí)間＞溫度。優(yōu)化得到的最佳提取條件為：料液比1∶16g/mL、溫度30℃、時(shí)間30min、pH10，在此條件下蛋白提取率預(yù)測值為64.75%，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中蛋白的得率為64.91%，相對偏差0.25%。

金針菇，蛋白，提取，響應(yīng)面法

金針菇學(xué)名毛柄金錢菌（Flammulina velutipes），又名枸菇、冬菇、樸菇等。金針菇具有豐富的營養(yǎng)成分，其精氨酸和賴氨酸等人體必需氨基酸的含量高于其他菇類，能有效增進(jìn)幼兒身高、體重和智力的發(fā)育，因此金針菇被譽(yù)為“增智菇”[1-3]。金針菇中還含有多糖、火菇素、倍半萜、免疫調(diào)節(jié)蛋白、核糖體失活蛋白等多種生物活性物質(zhì)，這些活性成分具有很高的藥用價(jià)值，具有抑制過敏反應(yīng)、抗氧化、抗疲勞、提高記憶力、減緩細(xì)胞衰老、延年益壽等功效[4-6]。

我國是食用菌生產(chǎn)大國，位居世界之首，占全球總產(chǎn)量的70%以上。隨著人們對食用菌消費(fèi)量的提高，金針菇的產(chǎn)銷量逐年上升[7]。金針菇在采收和加工過程中，產(chǎn)生大量的菌柄、菌蓋、畸形菇、劣質(zhì)菇等下腳料，目前少數(shù)以低價(jià)進(jìn)入市場或烤制成干菇，多數(shù)未經(jīng)處理而直接丟棄，而靠于基部的菌根由于其雜質(zhì)多、口感差被切下來直接被當(dāng)作垃圾扔掉，但這些下腳料中仍然含有大量的蛋白質(zhì)、纖維素等營養(yǎng)成分和活性成分。學(xué)者們的研究表明，金針菇菌根和上面部分子實(shí)體的主要營養(yǎng)成分種類相似，并且菌根中的蛋白質(zhì)含量為18%～25%，含量較高[8-9]。本論文以金針菇接近培養(yǎng)基部分的廢棄菌根為原料，研究影響菌根蛋白浸提率的因素，并利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，獲得最佳工藝參數(shù)。通過本研究能有效提高金針菇副產(chǎn)物和下腳料的價(jià)值，減少其對環(huán)境的污染，有效增加農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇 北京市天秀路菜市場；NaCl、NaOH、鹽酸等 國藥化學(xué)試劑有限公司，分析純；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250 美國Sigma公司。

DHP-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SL-100型高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠；pB-10 sartorius普及型pH計(jì) 美國賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金針菇菌根粉末的制備 將金針菇清理去雜后把上部子實(shí)體和菌根切分，菌根放入電熱鼓風(fēng)干燥箱50℃烘至恒重，萬能粉碎機(jī)粉碎，貯于干燥器備用。經(jīng)測定此菌根粉水分含量為6.5%。

1.2.2 金針菇菌根蛋白的提取 稱取已制備好的金針菇菌根粉，按一定的液料比加入提取劑，在一定溫度和pH下水浴提取一定時(shí)間后，8000r/min離心20min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量。

1.2.3 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL，配制成100μg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取出0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于6支具塞試管，分別加水補(bǔ)足到1mL，然后各加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑蓋上塞子，搖勻，室溫靜置2min后在595nm波長下比色測定。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 0.0063X+0.0055，相關(guān)系數(shù)R2=0.9973。

1.2.4 指標(biāo)的測定 菌根蛋白提取率的計(jì)算：蛋白提取率（%）=（上清液中蛋白質(zhì)量/菌根粉中總蛋白質(zhì)量）×100；菌根粉總蛋白測定采用凱氏定氮法（GB/T 15673-2009）；提取液蛋白的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[10-11]。水分含量測定采用直接干燥法（GB5009.3-2010）。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 提取劑對菌根蛋白提取率的影響 取粉末樣品按料液比1∶15（g/mL）加入三角瓶中，提取試劑分別為蒸餾水、0.14mol/L NaCl溶液和0.01mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），35℃水浴1h。比較水提法、鹽提法、緩沖液提取法對菌根蛋白提取效果的影響。

1.2.5.2 顆粒度對菌根蛋白提取率的影響 取顆粒度分別為40、60、80、100、120、150目金針菇菌根粉末，以料液比1∶15g/mL，0.14mol/L NaCl為提取液，調(diào)pH10，置于40℃水浴，提取60min。

1.2.5.3 料液比對菌根蛋白提取率的影響 取顆粒度100目的金針菇菌根粉末，0.14mol/L NaCl為提取液，調(diào)pH10，水浴溫度40℃，提取時(shí)間60min的條件下，研究1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25g/mL等料液比對菌根蛋白提取率的影響。

1.2.5.4 提取溫度對菌根蛋白提取率的影響 取顆粒度100目的金針菇菌根粉末，料液比1∶15（g/mL），0.14mol/L NaCl溶液為提取液，調(diào)pH10，分別置于冰箱（4℃），室溫（20℃），30、40、50℃水浴條件下，提取60min。

1.2.5.5 提取時(shí)間對菌根蛋白提取率的影響 取顆粒度100目的金針菇菌根粉末，料液比1∶15g/mL，0.14mol/L NaCl溶液為提取液，調(diào)pH10，分別在40℃水浴中提取0、10、20、30、40、50、60、90min。

1.2.5.6 pH對菌根蛋白提取率的影響 取顆粒度100目的金針菇菌根粉末，料液比1∶15（g/mL），0.14mol/L NaCl溶液為提取液，40℃水浴中提取60min條件下，pH分別調(diào)為8、9、10、11、12。

1.2.5.7 提取次數(shù)對菌根蛋白提取率的影響 一次浸提并不能將菌根中的蛋白完全提取出，將第1次浸提后的殘?jiān)^續(xù)進(jìn)行蛋白提取，提取條件和第1次浸提的相同，以此類推進(jìn)行第2次、第3次、第4次所得濾液合并，分別測定其蛋白含量。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定樣品顆粒度100目為實(shí)驗(yàn)材料，以稀鹽（0.14mol/L NaCl溶液）為提取液，提取次數(shù)為2次，在此條件下選擇有顯著影響的料液比、提取溫度、時(shí)間、pH為自變量，菌根蛋白提取率為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法[12]，建立菌根蛋白質(zhì)提取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型。自變量因素及編碼水平見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table.1 Variables and experimental design levels for response surface

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin8.0數(shù)據(jù)處理軟件和Design-Expert. 8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根蛋白提取率影響因素的研究

2.1.1 提取劑對菌根蛋白提取率的影響 水提法、鹽提法、緩沖液提取法對菌絲體蛋白提取效果的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。分析圖1可以看出，稀鹽（0.14mol/L NaCl溶液）的提取效果最好，緩沖液次之，直接水提法的提取率最低。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，三種試劑的提取效果的差異極顯著（p＜0.01）。原因在于稀濃度鹽可促進(jìn)蛋白質(zhì)鹽溶，并且鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，能夠保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性。因此，選擇稀鹽（0.14mol/L NaCl溶液）為提取試劑。

圖1 提取試劑對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of extraction reagent on extraction rate of protein

2.1.2 顆粒度對菌根蛋白提取率的影響 不同顆粒度對菌根蛋白提取率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著粉碎度的增加，蛋白提取率明顯增加；當(dāng)粉碎度大于100目后，增長趨勢平緩?？梢?，粉碎處理會(huì)破壞金針菇的細(xì)胞壁，有利于細(xì)胞內(nèi)有效成分的提取。但是，100、120、150目之間的蛋白提取率無顯著差異（p＞0.05），考慮到粉碎過細(xì)會(huì)造成產(chǎn)品的提取率提高不明顯，因此，選擇100目為適宜的顆粒度。

圖2 顆粒度對菌根蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of degree of grinding on extraction rate of protein

2.1.3 料液比對菌根蛋白提取率的影響 不同料液比對蛋白提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。分析圖3可以看出，隨著料液比的增加，蛋白的提取率增加，但料液比達(dá)1∶15以后提取率增幅較小，各處理間無顯著差異（p＞0.05）。較低的物料濃度有助于質(zhì)量擴(kuò)散作用的增強(qiáng)，但液料比過大會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)，且會(huì)給濃縮過程帶來負(fù)擔(dān)[13]。因此，選擇料液比1∶15進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 料液比對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of protein

2.1.4 提取溫度對菌根蛋白提取率的影響 不同提取溫度對蛋白提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。分析圖4可以看出，菌根蛋白的提取率隨著提取溫度的升高而增大，在30℃時(shí)達(dá)到最大；此后，隨溫度上升提取率反而下降。在提取溫度升高過程中，分子之間熱運(yùn)動(dòng)加劇，促使提取過程中傳質(zhì)速率上升，提取速率加快；但溫度過高，可能引起蛋白質(zhì)的聚集和沉淀，使其溶解度下降，從而降低了蛋白提取率[14]。

圖4 提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the Protein extraction rate

2.1.5 提取時(shí)間對菌根蛋白提取率的影響 不同提取時(shí)間對蛋白提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。分析圖5可以看出，隨著提取時(shí)間的延長，蛋白提取率逐漸增大，在30min時(shí)提取率達(dá)最大，此后延長時(shí)間提取率呈下降趨勢，可能是因隨時(shí)間延長導(dǎo)致蛋白變性，使提取率呈下降趨勢[15]。

圖5 提取時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the Protein extraction rate

2.1.6 pH對菌根蛋白提取率的影響 不同pH對蛋白提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。分析圖6可以看出，隨著提取液pH的升高，蛋白質(zhì)提取率增大，當(dāng)pH8～10之間蛋白質(zhì)提取率明顯增加（p＜0.05）；當(dāng)pH大于10后蛋白質(zhì)提取率增加緩慢，各處理間無顯著差異（p＞0.05）。隨著pH的增加，蛋白質(zhì)-水相互作用增強(qiáng)，溶解性提高。研究表明，過強(qiáng)的堿性會(huì)引起脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應(yīng)，將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸净衔?，同時(shí)氨基酸之間有可能發(fā)生縮合反應(yīng)產(chǎn)生異味[16]。

圖6 提取液pH對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.6 Effect of extracting solution pH value on Protein extraction rate

2.1.7 提取次數(shù)對菌根蛋白提取率的影響 不同提取次數(shù)對菌根蛋白的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，二次提取后蛋白提取率明顯大于第1次（p＜0.05），且第2、3、4次之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。這可能與菌根中水溶性蛋白在二次提取后基本浸出，提取劑蛋白質(zhì)濃度處于平衡有關(guān)，故選擇提取次數(shù)為2次。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析及提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 二次回歸方程數(shù)學(xué)模型的建立 固定0.14mol/L NaCl溶液為提取劑、顆粒度100目、提取次數(shù)為2次。以有顯著影響的料液比、提取溫度、時(shí)間、pH為自變量，菌根蛋白提取率為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.05數(shù)據(jù)分析軟件對表中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到金針菇蛋白提取率與料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）和pH（D）4個(gè)因素的數(shù)學(xué)回歸模型如下：

Y=63.96+4.03A+0.032B-0.041C+0.52D+0.67AB+ 0.32AC+1.58AD+3.60BC-1.32BD-2.20CD-5.58A2-4.64B2-6.11C2-4.63D2。對此回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，該模型的F=11.54，p＜0.0001，表明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)的F值為0.17，說明失擬項(xiàng)相對于誤差項(xiàng)來講不顯著；決定系數(shù)R2為0.9203，說明該模型的擬合性較好，可以用此模型對蛋白的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.2 交互作用分析 由表3還可以看出，A、BC、A2、 B2、C2、D2對蛋白質(zhì)提取率影響顯著。由F檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：A＞D＞C＞B，即：料液比＞pH＞時(shí)間＞溫度。

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table.2 Experimental designs and extraction results

方差分析結(jié)果表明，AB、AC、AD、BD、CD無明顯的交互作用，BC的交互作用顯著，即溫度和時(shí)間之間的交互作用對蛋白提取率有顯著影響，其交互作用響應(yīng)曲面如圖8所示。

從圖8可以看出，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，提取溫度在25℃至35℃之間，蛋白的提取率先是顯著增大，達(dá)到最大值后又開始慢慢減??；當(dāng)提取溫度一定時(shí)，提取時(shí)間在20min至40min之間，蛋白提取率先是漸漸增大，達(dá)到最大之后又開始慢慢減小。

2.2.3 回歸模型驗(yàn)證 由Design-Expert.8.05b分析軟件對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析結(jié)果表明，提取蛋白的最佳條件為料液比1∶16.14、溫度30.04℃、時(shí)間29.87min、pH10.12，蛋白提取率的理論值為64.75%?？紤]到實(shí)際操作，將蛋白提取條件修正為料液比1∶16、溫度30℃、時(shí)間30min、pH10，實(shí)測提取率為64.91%，相對偏差0.25%，可見該模型能較好地反映蛋白質(zhì)提取條件。

表3 回歸模型的方差分析Table.3 ANOVA for response surface quadratic model

圖8 提取溫度和時(shí)間交互影響蛋白質(zhì)提取率的曲面圖Fig.8 Response surface plot of the effect of operating temperature and time and their mutual interactions on the extraction rate of protein

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對影響金針菇菌根蛋白提取的因素：提取試劑、顆粒度、料液比、提取溫度、時(shí)間、pH、提取次數(shù)進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上選擇有顯著影響的四個(gè)因素，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和響應(yīng)面分析建立了回歸方程。由F檢驗(yàn)得到因子貢獻(xiàn)率為料液比＞pH＞時(shí)間＞溫度。利用優(yōu)化模型得到最佳提取條件為：料液比1∶16g/mL、溫度30℃、時(shí)間30min、pH10，實(shí)際提取率可達(dá)為64.91%，與理論值64.75%相對偏差為0.25%，證實(shí)了該模型的可行性，為金針菇菌根蛋白的提取提供了理論依據(jù)。

金針菇廢棄菌根具有很大的開發(fā)潛力，國內(nèi)外學(xué)者對金針菇功能成分提取的研究主要集中在子實(shí)體上。因此，為了充分開發(fā)利用金針菇廢棄菌根，有效提高金針菇副產(chǎn)物和下腳料的價(jià)值仍需加大科研力度，完善蛋白提取分離基本理論和方法，滿足工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。

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Optimization of extraction of protein from base of Flammulina velutipes using response surface methodology

ZHANG Le1，2，ZHOU Lin-yan1，SONG Hong-bo2，LI-Peng2，LI Ya-ru1，CAO Zhen-zhen1，WEI-Ming1，2，LI Shu-rong1，*
（1.Key Laboratory of Agro-product Processing and Quality Control/Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

In this study，extraction of proteins from base of Flammulina velutipes was investigated.Materials were crushed into 100 mesh powders，and 0.14mol/L NaCl buffer was used to extract for twice.Based on single factor experiments，solid-liquid ratio，extraction temperature，extraction time，and extraction pH were optimized using Box-Behnken design and response surface methodology for achieving maximum extraction rate of proteins.Factor contribution rate obtained from the F-test were as follows：solid-liquid ratio＞extraction pH＞extraction time＞extraction temperature.The optimum extraction parameters obtained from response surface analysis were as follows：solid-liquid ratio 1∶16g/mL，extraction temperature 30℃，extraction time 30min，and extraction pH10.Under the optimized conditions，the predicated extraction rate of proteins was 64.75%，meanwhile the rate of proteins was 64.91%in the validated experiment with the relative deviation value of 0.25%.

Flammulina velutipes；protein；extraction；the response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2014）06-0221-05

2013－08－02 *通訊聯(lián)系人

張樂（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工理論與應(yīng)用。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303080）。