大孔樹脂純化血管緊張素酶抑制肽VLPVPR的工藝優(yōu)化

李 艷，孫海燕，周麗珍，劉 冬

（深圳職業(yè)技術學院，深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室，廣東深圳518055）

大孔樹脂純化血管緊張素酶抑制肽VLPVPR的工藝優(yōu)化

李 艷，孫海燕，周麗珍，劉 冬*

（深圳職業(yè)技術學院，深圳市發(fā)酵精制檢測系統(tǒng)重點實驗室，廣東深圳518055）

考察大孔樹脂（AB8，D101，DM130，HPD100B，HPD826）對血管緊張素酶抑制肽VLPVPR的吸附性能及純化效果，確立純化VLPVPR的較優(yōu)工藝。結果表明，HPD100B最適于VLPVPR的純化。最優(yōu)純化工藝為：溫度20℃，pH9.8，上樣流速為3mL/（cm2·min），上樣量達到180mL，洗脫液乙醇溶液濃度為60%，洗脫流速為0.25mL/（cm2·min），洗脫體積為45mL。此條件下，VLPVPR的解吸率達93.1%，純度為28.8%，血管緊張素酶抑制率IC50為4.1μmol/L。

血管緊張素酶抑制劑，VLPVPR，大孔樹脂，純化

血管緊張素酶抑制肽是一類能通過抑制血管緊張素轉化酶活性從而達到降低血壓的小分子多肽，其主要來源于天然動植物及微生物蛋白質，具有降壓效果明顯、無毒副作用等特點[1-4]。目前，日本是血管緊張素酶抑制肽研究最多的國家，主要從乳清蛋白及魚類蛋白中提取。我國起步較晚，吳建平等[5]在對大豆降血壓肽的研究及酶系選擇和參數(shù)優(yōu)化方面做了許多研究。

VLPVPR（Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg）[6]是通過構建的基因工程菌E.coli BL21（pGEX-4T-2-AHP），重組的6拷貝串聯(lián)肽以融合蛋白GST-AHP形式由乳糖誘導表達，采用胰蛋白酶水解GST-AHP得到的血管緊張素酶抑制肽單體。肽分離的一般思路是先去除分子量較大、不水解的蛋白質，再根據(jù)分子量大小，采用凝膠過濾分離得到目的短肽。如果ACE抑制肽結構相近，則需根據(jù)電荷、分子極性差異等性質結合離子交換層析、疏水層析和RP-HPLC等其他分離方法來達到分離目的。劉冬等[7]在對利用基因工程技術生產降血壓肽研究中，采用親和層析法對GST-AHP進行分離，GST-AHP吸附量達3.86mg/mL，回收率達到96.5%，并通過RP-HPLC法對降血壓肽進行純化，可實現(xiàn)降血壓肽的完全分離，重組降血壓肽KVLPVP的IC50為4.6μmol/L，對ACE為競爭性抑制劑，動物實驗表明，給藥劑量為300ug/kg（體重）時，AHP對高血壓大鼠具有顯著降壓效果，而對血壓正常大鼠無顯著的降血壓作用。由于凝血酶和親和層析劑價格昂貴而導致操作成本過高，從而阻礙了VLPVPR的產業(yè)化前景。大孔樹脂[8-10]有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附量大、選擇性好、吸附速度快、價錢便宜等優(yōu)點，近年來廣泛應用于活性成分的分離純化。本文擬考察大孔樹脂對VLPVPR的純化效果，通過靜態(tài)吸附解吸實驗和動態(tài)吸附解吸實驗，選擇適宜的樹脂，并對其分離純化工藝條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血管緊張素抑制肽VLPVPR溶液 自制；大孔樹脂 見表1，滄州寶恩化工有限公司；三氟乙酸（TFA） 色譜純，日本東京化學工業(yè)株式會社；乙腈（ACN） 色譜純，天津協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司；VLPVPR標準品（純度大于95%） 西安美聯(lián)多肽合成有限公司；血管緊張素轉化酶馬尿酸（HA）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、血管緊張素轉化酶（ACE）美國Sigma公司；其他試劑 均為國產分析純。

表1 大孔樹脂的性能指標Table.1 The performance of macroporous resin

HEQ-X 100型振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；Prominence LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；層析柱（C16/40）、?KTA explorerTMGE Healthcare公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制備 采用RP-HPLC法測定血管緊張素抑制肽VLPVPR含量。具體方法如下：色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相組成：A相為100%水+0.05%（v/v）TFA，B相為100%ACN+0.05%（v/v）TFA；進樣體積為20μL，流速1mL/min，柱溫35℃，洗脫濃度為11.5%（B相）50min，檢測波長為199nm。

1.2.2 血管緊張素抑制肽VLPVPR溶液的制備 參考盧真保[11]的方法，利用已構建的E.coli BL21工程菌進行高密度發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心10min，收集菌體。每克濕菌體置于3mL含有2mol/L EDTA的1×PBS緩沖液中，加溶菌酶至終濃度20000U/mL，室溫放置30min后超聲破碎30min，4℃12000r/min離心10min，取上清液進行胰蛋白酶水解，酶解溫度為37℃，pH8.0，酶濃度為90U/mL樣品，酶解時間為4h，再12000r/min離心15min取上清液，過0.45μm膜。

1.2.3 樹脂預處理 樹脂用95%乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，去除上層漂浮的雜質和破碎的樹脂，過濾，再浸泡于0.1mol/L的NaOH 30min，用蒸餾水充分漂洗至中性，過濾，再浸泡于0.1mol/L的HCl 30min，用蒸餾水充分漂洗至中性，減壓抽干，備用。

1.2.4 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸

1.2.4.1 靜態(tài)解吸實驗 將充分吸附后的樹脂用蒸餾水洗滌至無溶液殘留，用濾紙吸干水分，加入50mL乙醇溶液，20℃，置于搖床以100r/min的速率振蕩12h，測定溶液中VLPVPR的濃度。吸取0.5mL檢測VLPVPR濃度。根據(jù)以下公式，計算各種樹脂對VLPVPR的解吸量及解吸率，考察洗脫液的濃度（60%、80%、95%）對樹脂洗脫性能的影響。

M2=C2×V2

M（%）=（M2/M1）×100

式中，M2：VLPVPR解吸量（mg）；C2：解吸液中VLPVPR濃度（mg/L）；V2：解吸液體積（L）；M：VLPVPR解吸率（%）。

1.2.4.2 靜態(tài)吸附實驗 分別準確稱取1.0g AB8、D101、DM130、HPD100B、HPD826經(jīng)預處理的干樹脂置于100mL錐形瓶中，加入樣品溶液50mL，一定溫度下，置于搖床上以100r/min的速率振蕩一定時間，測定溶液中VLPVPR的濃度。根據(jù)以下公式，計算各種樹脂對VLPVPR的吸附量及吸附率，考察樹脂種類（HPD100B、D101、AB8、HPD826、DM130）、pH（4、6、8、9.8、12）及溫度（20、30、40、50℃）對樹脂吸附性能的影響。

M1=（C0-C1）×V1

X（%）=（C0-C1）/C0×100

式中，M1：樹脂對VLPVPR吸附量（mg）；C0：吸附前溶液中VLPVPR濃度（mg/L）；C1：吸附后溶液中VLPVPR濃度（mg/L）；V1：溶液體積（L）；X：樹脂對VLPVPR吸附率（%）。

1.2.5 大孔樹脂動態(tài)吸附及解吸

1.2.5.1 動態(tài)吸附實驗 將預處理好的大孔樹脂（10.0g）濕法裝入到層析柱中，待樹脂自然沉降均勻后以2mL/（cm2·min）壓實填料，用60mL蒸餾水平衡，流速為1mL/（cm2·min）。將樣品溶液以一定的流速上柱，測定流出液中VLPVPR的濃度及純度，計算VLPVPR的動態(tài)吸附率，考察樣品溶液流速（2、3、4mL/（cm2·min））及上樣量（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32VB，其中VB為樹脂柱中樹脂體積）對樹脂吸附性能的影響，確定最佳吸附工藝條件。取10mL洗脫液，凍干，稱重。純度計算公式如下：純度（%）=m2/m1×100，其中，m1為10mL洗脫液凍干后質量（mg），m2為10mL洗脫液中VLPVPR的質量（mg）。

1.2.5.2 動態(tài)解吸實驗 對吸附飽和的樹脂進行洗脫實驗，以一定流速一定濃度一定量的乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中VLPVPR的濃度及純度，計算VLPVPR的動態(tài)解吸率，考察洗脫溶劑濃度（40%、50%、60%、70%、80%，v/v）、流速（0.125、0.25、0.5、1mL/（cm2·min））和體積（5、10、15、20、25、30、35、40、45mL）對樹脂解吸性能的影響，確定最佳解吸工藝條件。

1.2.6 血管緊張素轉化酶體外抑制活性的測定方法

通過RP-HPLC法測定馬尿酸的含量來評估樣品對ACE活性的抑制率。具體條件如下：色譜柱：VYDAC 238EV54 C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A相為100%ACN添加0.1%（v/v）TFA，B相為5%（v/v）ACN添加0.1%（v/v）TFA；洗脫梯度：A相30%～40%10min；流速：0.8mL/min；檢測波長：228nm；柱溫：30℃；進樣量：20μL。計算公式如下[12]：

式中：R：樣品對ACE的抑制率（%）；A：空白對照組中馬尿酸的峰面積；B：添加VLPVPR組中馬尿酸的峰面積。

在HHL和ACE酶的反應體系中分別加VLPVPR至終濃度為0、3、6、9、12、15μmol/L，測定抑制率，以VLPVPR濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標做曲線，從曲線查得IC50。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

VLPVPR標準品色譜圖見圖1。以液相相應面積為橫坐標，以VLPVPR濃度為縱坐標，繪制標準曲線（見圖2）。

圖1 VLPVPR液相色譜圖Fig.1 HPLC of VLPVPR

圖2 VLPVPR標準曲線Fig.2 Standard curve of VLPVPR

2.2 樹脂篩選結果與分析

2.2.1 不同時間樹脂靜態(tài)吸附實驗 實驗結果見圖3。結果表明，HPD100B與D101，有較高的吸附率，AB8與DM130次之，HPD826吸附率最低。五種樹脂均可作為VLPVPR的吸附樹脂，HPD100B更適合用來吸附VLPVPR。

圖3 樹脂吸附曲線Fig.3 Adsorption curve of different resins

樹脂與目標物質的極性和空間結構是影響吸附性能的重要因素。由于相似相溶原理，極性相近有利于樹脂與目標物質之間的吸附，大的孔徑有利于目標物質在樹脂顆粒內部的擴散，大的比表面則增強目標物質與樹脂的吸附能力。

實驗所用的樹脂分為氫鍵、中極性、非極性和弱極性三種類型。VLPVPR非極性功能團較多，理論上有利于被非極性樹脂吸附，實驗結果與理論一致，非極性樹脂HPD100B與D101對VLPVPR有較高的吸附率。HPD100B的吸附率高于D101，這可能是因為HPD100B的孔徑和比表面大于D101，更有利于VLPVPR在樹脂顆粒內部自由進出，并增強樹脂與VLPVPR間的吸附能力。

2.2.2 不同樹脂靜態(tài)解吸實驗結果及分析 用不同濃度的乙醇溶液對吸附飽和的樹脂進行解吸，結果見表2。

表2 各種樹脂非流動態(tài)解吸數(shù)據(jù)Table.2 Desorption data of different resins under static condictions

實驗結果表明，乙醇溶液濃度的增加，五種樹脂的解吸率均遞減，即乙醇濃度越高，越不利于解吸，這可能是因為VLPVPR的溶解度隨乙醇溶液的濃度增加而降低。濃度為60%的乙醇進行解吸時，HPD100B與AB8對VLPVPR的解吸率較高，均達到50%以上，D101與DM130次之，HPD826最低。

綜合靜態(tài)吸附與解吸實驗可知，五種樹脂中HPD100B對VLPVPR有較高的吸附率和解吸率，故確定HPD100B為分離純化VLPVPR的最佳樹脂。

2.3 靜態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.3.1 樣品pH對樹脂吸附效果的影響 pH影響VLPVPR電離程度，會改變VLPVPR分子極性，因此改變大孔樹脂對VLPVPR的吸附能力。pH會影響VLPVPR的溶解度，pH越接近等電點，VLPVPR的溶解度越低。吸附過程中，pH接近VLPVPR等電點時，VLPVPR在溶液中的溶解度下降，有利于VLPVPR向樹脂轉移。不同pH下VLPVPR吸附曲線見圖4。結果表明，當pH為9.8時，VLPVPR與樹脂間吸附力最強，吸附效果最好，這可能與VLPVPR在該pH下分子極性最弱有關（VLPVPR理論等電點為9.78）。

圖4 不同pH吸附曲線Fig.4 Adsorption curve of different pH

2.3.2 溫度對樹脂吸附效果的影響 不同溫度下VLPVPR吸附曲線見圖5。

圖5 不同溫度吸附曲線Fig.5 Adsorption curve of different temperatrue

結果表明，隨著溫度的升高，HPD100B對VLPVPR的吸附率逐漸降低。HPD100B是非極性樹脂，其與VLPVPR間的吸附主要是通過分子間作用力實現(xiàn)的。溫度升高，VLPVPR自身分子動能上升，熱運動加劇，其與樹脂間的作用力的減弱，故吸附過程應選擇低溫操作。故選擇20℃溫度。

2.4 動態(tài)吸附及解吸條件的優(yōu)化

2.4.1 動態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.4.1.1 上樣流速對VLPVPR吸附率與純度的影響流速對樹脂吸附的影響主要是由于影響溶質向樹脂表面擴散，從而影響了吸附效果。流速過高，溶質分子來不及擴散到樹脂的內表面，就會發(fā)生漏過。不同上樣流速下VLPVPR吸附率與純度結果如表3所示。

表3 上樣流速對VLPVPR吸附率與純度的影響Table.3 Influence of material different flow rate on VLPVPR yield and purity

結果表明上樣流速越慢，越有利于VLPVPR的吸附，原因在于低流速下，VLPVPR與樹脂間有充足的接觸時間，提高吸附率。從表3可以看出，上樣流速為2、3mL/（cm2·min）時VLPVPR幾乎沒有漏吸，因為樣品中VLPVPR含量很低，而樹脂的吸附量很大，流速快可以縮短生產周期。繼續(xù)升高上樣流速至4mL/（cm2·min）時，VLPVPR的吸附率和脫液中VLPVPR的純度均降低，因此，選擇上樣流速3mL/（cm2·min）為最佳的流速。

2.4.1.2 上樣體積對VLPVPR吸附率與純度的影響VLPVPR吸附透過曲線見圖6。圖6表明，當吸附體積達到32VB時，流出液中VLPVPR的濃度達到最大，HPD100B樹脂對VLPVPR具有較強的吸附。當上樣液體積為12VB時，流出液未檢測到VLPVPR，故選擇12VB即180mL為上樣體積，以防止VLPVPR漏吸。

圖6 流動態(tài)吸附透過曲線Fig.6 The dynamic curve of adsorption

2.4.2 動態(tài)解附條件優(yōu)化

2.4.2.1 解吸劑濃度對VLPVPR解吸率和純度的影響 不同濃度的乙醇溶液對VLPVPR解吸率和純度影響見表4。結果表明，隨著乙醇濃度的增加，VLPVPR的純度呈現(xiàn)上升的趨勢；當乙醇濃度達到60%時，VLPVPR的純度最高；繼續(xù)增大乙醇濃度，VLPVPR的純度有所降低。隨著乙醇濃度的增加，VLPVPR的解吸率呈現(xiàn)上升的趨勢；當乙醇濃度達到60%后，VLPVPR的解吸率最高，繼續(xù)增大乙醇濃度VLPVPR的解吸率降低。

一方面，乙醇溶液濃度不同，乙醇溶液的極性也不同，不同極性的乙醇溶液將影響VLPVPR與HPD100B的分子間作用力。另一方面，隨著乙醇溶液濃度的增加，VLPVPR在乙醇溶液中的溶解度減小。正是這兩種作用的相互競爭造成了VLPVPR的解吸率先上升，當乙醇濃度超過60%解吸率降低。另外，乙醇濃度超過60%時，VLPVPR的純度也下降，說明了高濃度的乙醇洗脫會帶來更多的雜質。綜合考慮以上因素，選擇60%的乙醇溶液作為分離VLPVPR的洗脫劑。

表4 乙醇濃度對VLPVPR分離效果的影響Table.4 Effect of alcohol concentration on yield and purity of VLPVPR

2.4.2.2 解吸劑流速對VLPVPR解吸率和純度的影響 不同流速下VLPVPR解吸率和純度的實驗結果見表5。結果表明，隨著洗脫流速的增大，VLPVPR的解吸率及純度均呈現(xiàn)下降的趨勢。其原因可能是洗脫速度增大，洗脫液與樹脂的作用時間縮短，洗脫液對VLPVPR的溶解還未達到飽和時就達到動態(tài)平衡，從層析柱流出，因此有部分VLPVPR被吸附在樹脂上而沒有被洗脫下來。另外，流速過快，VLPVPR與雜質在樹脂中來不及分開而一起洗脫流出。在流速為0.125、0.25mL/（cm2·min）時，VLPVPR解吸率與純度相差很小?？紤]低流速洗脫時間長，故選擇0.25mL/（cm2·min）為洗脫流速，解吸率為93.1%。

表5 不同乙醇流速對VLPVPR解吸率和純度的影響Table.5 Effect of different alcohol flow rate on yield and purity of VLPVPR

2.4.2.3 解吸劑體積對VLPVPR吸附率的影響 繪制動態(tài)解吸曲線，由圖7可知，采用60%的乙醇溶液進行洗脫時，洗脫峰集中，對稱，無明顯拖尾現(xiàn)象，采用3VB即45mL可將VLPVPR完全洗脫下來。

圖7 動態(tài)解吸曲線Fig.7 The desorptiom curve of dynamic state

2.5 血管緊張素轉化酶體外抑制活性的測定

馬尿酸標準品色譜圖見圖8，馬尿酸的保留時間為4.1min。以VLPVPR濃度為橫坐標，以ACE活性抑制率為縱坐標，繪制曲線（見圖9），VLPVPR的解析率達93.1%，純度為28.8%。當ACE活性抑制率為50%時，VLPVPR的濃度為4.1μmol/L，即IC50為4.1μmol/L。純化前的VLPVPR溶液因濃度太低，無法測定其血管緊張素轉化酶體外抑制活性。

圖8 馬尿酸標準品液相色譜圖Fig.8 Chromatography of hippuric acid standard

圖9 重組VLPVPR對ACE的抑制率Fig.9 Inhibitory rate of recombinant VLPVPR on ACE

3 結論

本實驗通過靜態(tài)吸附解吸實驗確定HPD100B對VLPVPR吸附率大，解吸率高，適用于VLPVPR的分離純化。大孔樹脂價錢便宜，廣泛應用于活性成分的分離純化中，利于VLPVPR的產業(yè)化應用。結合靜態(tài)吸附解吸結果，通過動態(tài)吸附實驗確定VLPVPR最優(yōu)的純化工藝條件為：溫度20℃，pH為9.8，上樣流速為3mL/（cm2·min），上樣量為180mL，洗脫液乙醇溶液濃度為60%，洗脫流速為0.25mL/（cm2·min），洗脫體積為45mL。采用最優(yōu)純化條件，VLPVPR的解吸率達93.1%，純度為28.8%，ACE酶抑制活性IC50為4.1μmol/L。

[1]Yamamoto N，Ejiri M，Mizuno S.Biogenic peptides and their potential use[J].Curr Pharm Des，2003，9（16）：1345-1355.

[2]李世敏，劉冬，孫海燕，等．玉米活性多肽降血壓作用及其機制的研究[J]．營養(yǎng)學報，2007，29（2）：186-188．

[3]Fujita H，Yokoyama K，Yoshikawa M.Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins[J].J Food Sci，2000，65（4）：564-569.

[4]Fitz Gerald RJ，Meisel H.Milk protein-derived peptide inhibitors of angiotensin I-converting enzyme[J].BrJ Nutr，2000，84（1）：33-37.

[5]吳建平，丁霄霖.大豆降壓肽的研制（Ⅰ）—生產高活性ACEI肽酶系的篩選[J].中國油脂，1998，23（2）：49-51.

[6]Liu D，Sun H，Zhang LJ，et al.High-level expression of milkderived antihypertensive peptide in Escherichia coli and its bioactivity[J].J Agric Food Chem，2007，55（13）：5109-5112.

[7]Liu D，Li SM，Zhang LJ，et al.Construction of angiotensinconverting enzyme inhibitory peptide gene and expression of the fusion protein in E.coli[J].ACS National Meeting，2004：211-221.

[8]曹增梅，黃和.大孔樹脂純化番石榴多酚的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（7）：215-218.

[9]邵盈盈，李向榮.大孔樹脂純化藍莓總黃酮及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（7）：73-76.

[10]冀德富，郭東艷.HPD100大孔樹脂純化葉下珠總多酚的工藝研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（1）：240-242.

[11]盧真保，劉冬，李世敏，等.胰蛋白酶水解工程菌表達產物制備重組降血壓肽[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（5）：412-414.

[12]劉力生.高血壓[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.

Optimization of purification process of angiotensin converting enzyme inhibitor peptide VLPVPR with macroporous resin

LI Yan，SUN Hai-yan，ZHOU Li-zhen，LIU Dong*
（Shenzhen Polytecnic，Shenzhen Key Laboratory of Fermentation，Purification and Analysis，Shenzhen 518055，China）

To separate and purify angiotensin converting enzyme inhibitor peptide VLPVPR，the absorption capability and purification effect of VLPVPR on macroporous resin were evaluated.Adsorption and desorption experiments were carried out to screen the suitable macroporous resin for VLPVPR.HPD100B was the best macroporous resin for purification of VLPVPR.The optimization condition were temperature 20℃，pH9.8，feeding rate 3mL/（cm2·min），feeding volume 180mL，ethanol concertration 60%，elute rate 0.25mL/（cm2·min）and elute volume 45mL.The desorption ratio was 93.1%，the purity ratio was 28.8%and the inhibition ratio（IC50）of the ACE was 4.1μmol/L.

angiotensin converting enzyme inhibitor peptide；VLPVPR；macroporous resin；purification

TS201.1

B

1002-0306（2014）06-0206-06

2013－06－21 *通訊聯(lián)系人

李艷（1982-），女，博士研究生，助理研究員，研究方向：生物活性物質功效及應用。

廣東省科技計劃項目（2011B010500006）；廣東省高等職業(yè)院校珠江學者崗位計劃資助項目（2011）。