α-乳白蛋白單克隆抗體的制備及斑點(diǎn)印跡定性檢測(cè)方法的建立

龍彩云，鄭義成，程芬芬，楊安樹，*，陳紅兵

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047）

α-乳白蛋白單克隆抗體的制備及斑點(diǎn)印跡定性檢測(cè)方法的建立

龍彩云1，2，鄭義成1，2，程芬芬1，2，楊安樹1，2，*，陳紅兵1，2

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌330047）

以α-乳白蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備抗α-乳白蛋白單克隆抗體；采用碳二亞胺法，并通過工藝優(yōu)化，將單抗與量子點(diǎn)高效偶聯(lián)；在此基礎(chǔ)上，建立了基于斑點(diǎn)印跡技術(shù)定性檢測(cè)乳制品中過敏原α-乳白蛋白的方法。結(jié)果表明：采用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體特異性好，與牛奶中其他蛋白無交叉反應(yīng)；當(dāng)量子點(diǎn)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、單抗摩爾比為1∶10∶6∶4時(shí)，量子點(diǎn)與單抗有較好的偶聯(lián)效果；以量子點(diǎn)標(biāo)記單抗建立的斑點(diǎn)印跡方法可直觀、快速的定性分析乳制品中過敏原α-乳白蛋白。因此，該方法具有一定的實(shí)用價(jià)值。

α-乳白蛋白，單克隆抗體，量子點(diǎn)，斑點(diǎn)印跡，定性檢測(cè)

牛乳及其乳制品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是人們攝取蛋白質(zhì)的重要來源；同時(shí)，牛乳又是主要的過敏食物之一[1]。其中，牛乳中α-乳白蛋白與人乳α-乳白蛋白的氨基酸殘基有很高的相似度，對(duì)初生嬰兒來說是一種很重要的蛋白質(zhì)來源，但該蛋白又被認(rèn)為是牛乳中主要的過敏原之一[2]。據(jù)報(bào)道，超過19%的牛乳過敏均是由α-乳白蛋白引起[3]。因此，開展針對(duì)食品中α-乳白蛋白的檢測(cè)研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

目前，用于過敏原檢測(cè)的主要方法為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），該法具有高的靈敏度，但檢測(cè)步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)。在DNA檢測(cè)水平上，聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）因其更高的靈敏度而被報(bào)道是最有可能替代ELISA的方法，然而利用PCR法檢測(cè)過敏原也存在一定的缺陷，即DNA和過敏原的含量之間沒有確切的相關(guān)性，從而易導(dǎo)致過敏原檢測(cè)的假陽(yáng)性或假陰性。

單克隆抗體因其高特異性和靈敏度而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、食品安全檢測(cè)等眾多領(lǐng)域[4-6]。在食品安全快速檢測(cè)中，免疫技術(shù)結(jié)合熒光分析具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏等特點(diǎn)。近年來，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域，量子點(diǎn)常代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光標(biāo)記物用于免疫學(xué)檢測(cè)[7-12]。基于單克隆抗體識(shí)別抗原的特異性和量子點(diǎn)熒光的靈敏性，本文以α-乳白蛋白為抗原免疫小鼠制備單抗，利用碳二亞胺法將抗α-乳白蛋白單抗與CdSe/ZnS量子點(diǎn)偶聯(lián)，再以量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體構(gòu)建斑點(diǎn)印跡法來定性檢測(cè)乳制品中過敏原α-乳白蛋白，彌補(bǔ)了我國(guó)基于量子點(diǎn)標(biāo)記單抗技術(shù)快速檢測(cè)乳制品中過敏原的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性BALB/c小鼠 （20±2）g，6周齡，南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；α-乳白蛋白（純度≥95%） 實(shí)驗(yàn)室自制；α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、EDC、NHS、明膠、弗氏佐劑 Sigma公司；CdSe/ZnS量子點(diǎn)、Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞 江蘇無錫中德伯爾生物有限公司；奶茶1、花生牛奶1、奶茶2、酸酸乳、純牛奶、花生牛奶2 市購(gòu)；超濾離心管 美國(guó)Millipore公司；Sephadex-G200 美國(guó)GE公司；其他試劑 均為分析純。

微量蛋白核酸測(cè)定儀、凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad公司；960CRT熒光分光光度計(jì) 上海精科公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單克隆抗體的制備與純化 抗α-乳白蛋白單克隆抗體的制備參照Richter等[13]方法。首次免疫將弗氏完全佐劑（CFA）與等體積α-乳白蛋白乳化后皮下多點(diǎn)注射小鼠，劑量為50μg/只，以后每隔14d以弗氏不完全佐劑（IFA）與等體積α-乳白蛋白乳化后免疫小鼠，劑量為50μg/只，共免疫4次。期間采用間接ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)，待血清效價(jià)達(dá)到一定水平后，用25μg不加佐劑的抗原采用尾靜脈注射途徑每只加強(qiáng)免疫1次。于3d后取小鼠脾細(xì)胞與生長(zhǎng)旺盛期Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過PEG介導(dǎo)融合并培養(yǎng)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液開始變黃，或細(xì)胞長(zhǎng)至孔底1/4時(shí)，利用間接ELISA方法檢測(cè)上清液以篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，再以有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，直至得到100%陽(yáng)性孔。將得到的單克隆株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，或通過凍存液處理后轉(zhuǎn)入液氮凍存，或?qū)㈦s交瘤細(xì)胞株注入小鼠腹腔制備腹水單抗，然后采用辛酸-硫酸銨法純化腹水單抗[14]。利用間接ELISA方法和蛋白微量測(cè)定儀分別測(cè)定抗體效價(jià)和濃度。

1.2.2 免疫印跡檢測(cè)單克隆抗體的特異性 取乳清及純化后的α-乳白蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠4%，分離膠12%）；電泳結(jié)束后，將膠取出置于電印跡緩沖液（10mmol/L CAPS，10%甲醇，pH11.0）中10min，利用半干法于50mA下恒流轉(zhuǎn)膜1h；電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將PVDF膜置于1%明膠中37℃封阻1h。封阻結(jié)束后取出膜，TBST洗滌三次，每次10min，然后于純化單抗溶液（1∶2000）中4℃孵育反應(yīng)過夜。轉(zhuǎn)入TBST洗滌三次，加入1∶5000稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗溶液（1∶5000）中，37℃下孵育1h。37℃避光顯色20min。電轉(zhuǎn)結(jié)束后的每一步反應(yīng)均需用TBST洗滌三次，10min/次。

1.2.3 量子點(diǎn)偶聯(lián)標(biāo)記單克隆抗體 采用碳二亞胺法將CdSe/ZnS量子點(diǎn)與抗α-乳白蛋白單抗進(jìn)行偶聯(lián)[11，15]。具體方法如下：取0.32nmol的CdSe/ZnS量子點(diǎn)，依次加入EDC和NHS的PBS溶液（pH7.4）活化，分別反應(yīng)5min，然后加入單抗于37℃搖床上避光反應(yīng)2h。偶聯(lián)產(chǎn)物用超濾離心管（MWCO：3000u）離心分離，取上清液用Sephadex-G200層析柱純化，并在紫外成像系統(tǒng)下觀察分析。

1.2.4 樣品前處理 對(duì)于液態(tài)奶制品，取1mL樣品于8000r/min下離心10min，去除脂肪層后，分別取10μL稀釋100倍后作為檢測(cè)樣品。對(duì)于固態(tài)奶制品，可用PBS緩沖液配成0.1g/mL的溶液，離心去沉淀，取10μL上清液稀釋100倍后作為檢測(cè)樣品。

否則的話，如果認(rèn)為著作權(quán)也如同物權(quán)一樣，除了賦予著作權(quán)人禁止及許可他人以法律規(guī)定的方式利用其作品外，還賦予了著作權(quán)人以法律規(guī)定的方式利用自己作品的自由，那將得出一些荒謬的結(jié)論。作者對(duì)自己作品的利用，本來就是每個(gè)公民的自由，無須法律授權(quán)。著作權(quán)法中未規(guī)定的權(quán)利，是著作權(quán)人所不能控制的，公眾合理利用作品的自由。而保護(hù)著作權(quán)人自己使用作品的自由不被侵害，根本不是著作權(quán)法所要解決的問題。

1.2.5 斑點(diǎn)印跡定性檢測(cè) 剪取適宜大小的硝酸纖維膜，用鉛筆劃格，置于PBS緩沖液中活化20min；取出放置一定時(shí)間至適宜濕度后，分別吸取3μL倍比稀釋的α-乳白蛋白、處理后樣品以及PBS緩沖液緩慢點(diǎn)于膜上，在一定濕度、37℃下孵育1h后，再用1%明膠封閉1h；隨后吸取等體積量子點(diǎn)標(biāo)記的單抗分別與抗原反應(yīng)，37℃下孵育2h。以上每一步驟均須用TBST洗滌三次。完成后，將膜置于紫外成像系統(tǒng)下觀察其熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單抗的制備及表征

小鼠免疫過程中抗血清效價(jià)的變化趨勢(shì)見圖1，由圖1可知，初次免疫后小鼠血清未見明顯效價(jià)，隨著免疫進(jìn)程的進(jìn)行，抗血清效價(jià)逐漸上升，小鼠免疫4次后，1、3號(hào)小鼠血清效價(jià)達(dá)十萬(wàn)，3號(hào)小鼠血清效價(jià)上升最為平穩(wěn)，滿足融合實(shí)驗(yàn)的要求，因此選取3號(hào)小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

圖1 免疫過程中抗血清效價(jià)的變化Fig.1 Change of the titer of serum during immunization by ELISA

經(jīng)過細(xì)胞融合、篩選、有限稀釋等過程，共得到22株單克隆抗體。根據(jù)其親本細(xì)胞所來源的初始細(xì)胞孔，挑選4株擴(kuò)大培養(yǎng)，分別命名為A1G8、K1E1H1、K1E3F6和K1E7。各細(xì)胞株通過體內(nèi)培養(yǎng)誘生法大量制備單抗腹水，測(cè)定其效價(jià)為3×105。小鼠腹水中還含有白蛋白、脂肪、脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選擇辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀的方法純化腹水單抗。在酸性（pH4.5）下，非IgG類蛋白成分能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀，則上清中剩余蛋白主要為IgG類抗體，再用45%飽和硫酸銨溶液沉淀上清液能得到高純度的IgG抗體。純化后所得的抗體稀釋一定倍數(shù)后測(cè)定其濃度，結(jié)果見表1，從表1中可知純化所得抗體濃度較高，最低可達(dá)3.2mg/mL，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表1 純化后單克隆抗體濃度Table.1 Concentration of monoclonal antibody after purification

蛋白電泳圖及免疫印跡結(jié)果如圖2所示，從電泳圖2（a）中可見，牛乳清蛋白中主要為α-乳白蛋白及β-乳球蛋白條帶；而經(jīng)轉(zhuǎn)膜印跡結(jié)果如圖2（b）所示，可見在14ku左右有印跡條帶，即為α-乳白蛋白印跡條帶，而未見β-乳球蛋白等乳清中其他蛋白的印跡條帶，表明得到的單克隆抗體對(duì)乳白蛋白具有較好的特異性，與乳清中其他蛋白無交叉反應(yīng)。

圖2 牛乳α乳白蛋白和乳清蛋白SDS-PAGE電泳（a）及免疫印跡（b）Fig.2 SDS-PAGE patterns（a）and western blotting（b）of mAbs with α-La and whey protein注：M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1：α-乳白蛋白；2：乳清蛋白。

2.2 量子點(diǎn)偶聯(lián)單抗條件的優(yōu)化

在偶聯(lián)反應(yīng)體系中，當(dāng)選用摩爾比為量子點(diǎn)∶EDC∶NHS∶單抗=1∶1000∶1000∶2時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后溶液中有沉淀，通過離心、超濾后，分別取該沉淀及超濾截留液于紫外燈下成像觀察，如圖3（A）所示，沉淀有較強(qiáng)熒光，而超濾截留液熒光很弱。推測(cè)可能是由于EDC、NHS量太高導(dǎo)致量子點(diǎn)完全沉淀或熒光淬滅。減少體系中EDC、NHS的使用量，以量子點(diǎn)∶EDC∶NHS∶單抗=1∶100∶6∶2比例偶聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液中仍然有沉淀，經(jīng)同樣處理后，發(fā)現(xiàn)沉淀有較強(qiáng)熒光，超濾截留液有較弱熒光（圖3B），說明此次量子點(diǎn)未完全沉淀，但EDC的量仍過多。因此，進(jìn)一步減少EDC的使用量，按量子點(diǎn)∶EDC∶NHS∶單抗=1∶10∶1∶2比例進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，沒有沉淀出現(xiàn)，偶聯(lián)物和超濾截留液于紫外下觀察（圖3C），均有較強(qiáng)熒光，但強(qiáng)度不均勻，這可能是EDC和NHS的比例不合適，或單抗量少，從而造成偶聯(lián)反應(yīng)混亂，偶聯(lián)率低。因此，選用量子點(diǎn)∶EDC∶NHS∶單抗=1∶10∶6∶4比例偶聯(lián)，同樣未發(fā)現(xiàn)沉淀，從圖3（D）中可見，偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)超濾濃縮后濾液無熒光，截留液熒光較強(qiáng)且均勻，可見在此比例下偶聯(lián)效果較好。

EDC與NHS是常用的偶聯(lián)試劑[16-17]，在中性條件下，EDC可與量子點(diǎn)表面羧基反應(yīng)，生成酯類活性中間體QD-EDC，該中間體的酯鍵不穩(wěn)定、易水解；而在NHS存在的情況下，該中間體可與NHS反應(yīng)生成另一活性中間體QD-NHS，QD-NHS較QD-EDC更穩(wěn)定。在有氨基存在下，QD-NHS的酯鍵可水解，并與蛋白質(zhì)表面的氨基共價(jià)結(jié)合形成肽鍵。通過優(yōu)化偶聯(lián)條件發(fā)現(xiàn)EDC的使用量過多會(huì)造成量子點(diǎn)沉淀或熒光淬滅，原因可能在于反應(yīng)過程中交聯(lián)混亂而形成高聚合物[18]。另外，單抗的量對(duì)偶聯(lián)也有影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：量子點(diǎn)與單抗兩者摩爾比為1∶2時(shí)，其偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度不如摩爾比為1∶4時(shí)的均勻，這可能是隨著單抗量的增加，量子點(diǎn)能更多的參與偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)效率提高。

圖3 偶聯(lián)產(chǎn)物紫外成像圖Fig.3 Ultraviolet imagery of the conjugates

利用凝膠過濾層析分子篩作用原理，可將偶聯(lián)物與游離抗體及量子點(diǎn)分離；同時(shí)，還可除去少量的EDC和NHS，從而保證偶聯(lián)產(chǎn)物有較高的純度和均一性，滿足后續(xù)檢測(cè)分析的要求。

圖4 斑點(diǎn)印跡定性檢測(cè)不同乳制品中α-乳白蛋白Fig.4 Qualitative detection for α-La in different dairy products by using dot blotting

2.3 斑點(diǎn)印跡定性檢測(cè)

量子點(diǎn)具有寬激發(fā)、窄發(fā)射等熒光特性，因此，量子點(diǎn)標(biāo)記單抗的偶聯(lián)物在紫外光激發(fā)下能產(chǎn)生熒光。以建立的斑點(diǎn)印跡法定性檢測(cè)不同乳制品中α-乳白蛋白，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著α-乳白蛋白點(diǎn)樣量減少，其對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度也逐漸減弱，且空白處斑點(diǎn)未見明顯的熒光本底，因此可見該偶聯(lián)物可特異性結(jié)合過敏原α-乳白蛋白。通過斑點(diǎn)強(qiáng)度的不同可定性檢測(cè)各種乳制品中α-乳白蛋白含量的高低。在6種待檢測(cè)乳制品中，純牛奶及酸酸乳中α-乳白蛋白含量最高，其次為花生牛奶1，而奶茶1中α-乳白蛋白含量很低。斑點(diǎn)印跡過程操作簡(jiǎn)便且時(shí)間短，對(duì)儀器要求不高。綜上所知，該量子點(diǎn)標(biāo)記抗體是一種可行的快速檢測(cè)材料，通過斑點(diǎn)印跡法可直觀、快速、準(zhǔn)確的定性分析乳制品中過敏原α-乳白蛋白。

3 結(jié)論

通過細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和體內(nèi)誘生腹水法可大量制備抗α-乳白蛋白單克隆抗體，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀所得抗體的濃度較高，且特異性好，幾乎無交叉反應(yīng)，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。采用碳二亞胺法將量子點(diǎn)與單抗偶聯(lián)，通過工藝優(yōu)化，結(jié)果表明：量子點(diǎn)∶EDC∶NHS∶單抗=1∶10∶6∶4時(shí)，偶聯(lián)效果最佳；經(jīng)凝膠層析純化后保證了該偶聯(lián)物具有較高的純度和均一性。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于量子點(diǎn)標(biāo)記單抗的斑點(diǎn)印跡技術(shù)，該方法快速、便捷、特異性強(qiáng)，借助紫外成像系統(tǒng)可直觀、定性檢測(cè)乳制品中α-乳白蛋白。

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Development of monoclonal antibodies against α-lactalbumin and establishment of qualitative detection for α-lactalbumin with dot blotting assay

LONG Cai-yun1，2，ZHENG Yi-cheng1，2，CHENG Fen-fen1，2，YANG An-shu1，2，*，CHEN Hong-bing1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Sino-German Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

The monoclonal antibodies（mAbs）against bovine α-lactalbumin（α-la）were prepared by immunning Balb/c mice and the lymphocyte hybridoma technique.The mAbs were covalently conjugated with the CdSe/ ZnS quantum dots（QDs）by the carbodiimide crosslinking method，and then the coupling conditions were optimized.Furthmore，a dot blotting method based on QD-mAb conjugates was established to qualitatively detect α-La in different commercial dairy products.The results showed that the prepared mAbs had high specificity and no cross-reaction.A good coupling effect was confirmed when the molar ratio of QD，N-（3-Dimethylaminopropyl）-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride（EDC），N-Hydroxysuccinimide（NHS），monoclonal antibody was 1∶10∶6∶4.The developed method based on QD-mAb conjugates could be used to visual，rapid qualitative analyze α-La in dairy products.Accordingly，the method possesses certain practical value.

α-lactalbumin；monoclonal antibody；quantum dots；dot blotting；qualitative detection

TS252.7

A

1002-0306（2014）06-0185-04

2013－07－19 *通訊聯(lián)系人

龍彩云（1989-），女，碩士研究生，研究方向：生物化工。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2013AA102205）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAK10B03）；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對(duì)象計(jì)劃（20122BCB23006）；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20122BAB204001）。