γ-聚谷氨酸發(fā)酵液預處理及提取純化工藝

賀楊揚，曾 偉，王青龍，陳桂光，梁智群，*

（1.廣西大學，生命科學與技術學院，廣西南寧530004；2.廣西大學亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004）

γ-聚谷氨酸發(fā)酵液預處理及提取純化工藝

賀楊揚1，2，曾 偉1，2，王青龍1，2，陳桂光1，2，梁智群1，2，*

（1.廣西大學，生命科學與技術學院，廣西南寧530004；2.廣西大學亞熱帶農業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530004）

采用醇析和鹽析結合的方法提取γ-PGA粗品。最佳稀釋倍數為2倍，硅藻土和粉末活性炭（顆?；钚蕴浚┯昧糠謩e定為10g/L和10g/L（15g/L），在室溫下抽濾最佳pH為3.0。用5%NaCl和一倍體積乙醇提取γ-PGA，經過冷凍真空干燥可得到白色顆粒狀γ-PGA粗品，提取率為95.21%，純度可達96.89%，大大降低了乙醇用量，節(jié)約了生產成本。

γ-聚谷氨酸，預處理，硅藻土，活性炭，提取

γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是自然界中微生物來源的一種強水溶性多聚高分子化合物，具有良好的生物可降解性、生物相容性、可食用性、低免疫原性、保濕性等[1]，對人體和環(huán)境無毒無公害，可廣泛應用于工業(yè)、農業(yè)、食品、醫(yī)藥、化妝品等領域[2-3]。隨著γ-PGA在很多新領域中的應用拓展，其相關研究越來越受到人們關注。國內許多學者研究提取制備γ-PGA的方法，但是發(fā)酵液粘度高，菌液分離難度大，發(fā)酵液成分復雜，純化難度較大，以致純化成本高。目前，常用的除菌方法主要有高速離心法、絮凝法和微孔濾膜法等。但每種方法都存在一定的局限性，不能有效應用于工業(yè)化生產中。要想得到純度高的γ-PGA，菌液分離是關鍵步驟。γ-PGA提取方法主要有有機溶劑沉淀法、銅鹽沉淀法和膜分離沉淀發(fā)，Do等[4]采用酸化、離心、微濾、超濾濃縮、醇析、真空干燥的方法有效提取γ-PGA，與傳統的醇析相比，節(jié)省了乙醇用量，降低了生產成本。目前，常用的γ-PGA提取方法是乙醇提取法，一般添加2～4倍體積乙醇[5-7]。Jin人發(fā)現，乙醇用量的多少與γ-PGA濃度有關，γ-PGA濃度增加，乙醇用量將顯著減少。采用超濾濃縮方法增加γ-PGA濃度[8]，高濃度的γ-PGA有助于減少乙醇的用量及后期酒精回收的能耗，減少生產成本。因此，如何建立一條高效、經濟的γ-PGA提取純化工藝，是今后國內亟待解決的課題之一。

本實驗對Bacillus subtilis GXA-28微生物發(fā)酵得到的發(fā)酵液進行預處理，利用稀釋和酸化發(fā)酵液降低體系粘度，加入適量硅藻土和活性炭有效地除去發(fā)酵液中的菌體和雜蛋白等。采用醇析和鹽析結合的方法提取γ-PGA，不僅能有效減少乙醇用量而且得到高純度的γ-PGA粗品，建立了一條高效可行且經濟的γ-PGA提取純化工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌 本實驗室自主篩選枯草芽孢桿菌GXA-28（B.subtilis GXA-28）[9]，菌株保藏編號CCTCC M 2012347；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖10，酵母膏5，谷氨酸鈉5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，蒸餾水1L，pH6.5±0.5；斜面培養(yǎng)基（g/L） 成分同種子培養(yǎng)基，加瓊脂粉15，蒸餾水1L，pH6.5±0.5；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖30，酵母膏2.5，谷氨酸鈉20，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.1，蒸餾水1L，pH6.5±0.5。

J2-21型高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司；HH4-數顯恒溫水浴鍋 國樺電器有限公司；HVE-50自動滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司；320pH Meter Merter Toledo 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；NDJ-8S型旋轉粘度計 上海平軒科學儀器有限公司；SKY-211C型搖床 上海蘇坤實業(yè)有限公司；SHB-III型抽濾真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 取一環(huán)斜面菌種接于種子培養(yǎng)基中，42℃，160r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)16h。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng) 按2%接種量吸取種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，42℃，160r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)22h。

1.2.2 發(fā)酵液的預處理

1.2.2.1 溫度和pH的選擇 溫度對發(fā)酵液粘度有一定的影響，因此，在20、30、40℃下分別考察pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時，溫度和pH對發(fā)酵液粘度的影響。

1.2.2.2 稀釋體積的選擇 將γ-PGA發(fā)酵液（初始體積為V），加入不同體積去離子水稀釋，稀釋倍數依次為2、3、4、5、6、7，分別將稀釋液進行離心和抽濾，比較離心和抽濾對發(fā)酵液預處理的影響。

1.2.2.3 pH的選擇 pH對γ-PGA發(fā)酵液粘度影響很大，發(fā)酵液粘度不宜過高，否則不利于抽濾，也不宜過低，否則會破壞γ-PGA分子結構。因此，分別調pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5。

1.2.2.4 硅藻土添加量的確定 在等體積γ-PGA發(fā)酵酸化液中分別加入5、10、15、20、25、30g/L硅藻土，充分攪拌，在相同條件下抽濾，將沒有添加硅藻土的發(fā)酵液作為對照，取少量發(fā)酵液12000r/min，離心20min，除菌體和雜質得到上清液，比較抽濾和離心除菌和除雜蛋白的效果，同時比較兩種方法對γ-PGA回收率的影響。

1.2.2.5 活性炭濃度的確定 脫色劑種類和濃度對發(fā)酵液預處理有重要影響，因此通過比較粉末活性炭和顆?；钚蕴繉w量、雜蛋白含量及γ-PGA回收率的影響，從而選出最佳濃度的脫色劑。粉末活性炭濃度為1、5、10、15、20、25g/L，活性炭顆粒濃度依次為5、10、15、20、25、30g/L。

1.2.2.6 硅藻土和活性炭用量比例的確定 將硅藻土的濃度定為10g/L，粉末活性炭和顆?；钚蕴康挠昧恳来螢椋?、10、15、20、25、30g/L。通過抽濾除菌、除雜蛋白等，硅藻土用量相同的條件下，比較不同用量活性炭對發(fā)酵液預處理的影響。

1.2.3 γ-PGA的提取 將預處理的發(fā)酵液直接醇析得到的是酸型的γ-PGA，將發(fā)酵液回調pH至6～7后再醇析得到的是鈉鹽型γ-PGA。本實驗采用NaCl和乙醇共同提取γ-PGA的方法，取20mL預處理發(fā)酵液，通過控制NaCl和乙醇的用量，經冷凍真空干燥后，可得到顆粒狀γ-PGA粗品。比較NaCl濃度為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%條件下，得到不同分子形態(tài)的γ-PGA需要乙醇的用量。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 γ-PGA濃度測定 參考文獻[10]。

1.2.4.2 多糖含量測定 硫酸苯酚法[11]。

1.2.4.3 雜蛋白含量的測定 考馬斯亮藍G-250法[12]。

1.2.4.4 菌體量測定 發(fā)酵液經蒸餾水稀釋10倍，660nm下測定吸光度。

1.2.4.5 粘度測定 取400mL發(fā)酵液至于500mL燒杯中，采用NDJ-8S型旋轉粘度計，4號轉子，轉速60r/min。

1.2.4.6 細胞干重測定 稱重法。將真空干燥后得到的粗品用萬分之一克電子天平稱重并減去離心管質量即得到γ-PGA粗品質量。

1.2.5 計算公式 如下所示：

除菌率（%）=（原發(fā)酵液OD660-除菌后發(fā)酵液的OD660）/原發(fā)酵液的OD660×100

除雜蛋白率（%）=（原發(fā)酵液雜蛋白濃度-除菌后發(fā)酵液雜蛋白濃度）/原發(fā)酵液雜蛋白濃度×100

γ-PGA回收率（%）=除菌后發(fā)酵液γ-PGA濃度/原發(fā)酵液γ-PGA濃度×100

γ-PGA提取率（%）=γ-PGA干重/發(fā)酵后γ-PGA產量×100

γ-PGA純度（%）=0.1g烘干的γ-PGA復溶后OD216測得的濃度/100μg/mL×100

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵液的預處理

2.1.1 溫度和pH對γ-PGA發(fā)酵液粘度的影響 初始發(fā)酵液為淡黃色粘稠狀液體，pH在5.6左右，發(fā)酵液中γ-PGA產量較高（約19g/L），由于初始發(fā)酵液粘度很高，分離純化困難。Jin[4]在35℃下，將發(fā)酵液pH調至3.0，粘度下降，有利于提取分離γ-PGA。實驗結果如圖1所示。

圖1 溫度和pH對發(fā)酵液粘度的影響Fig.1 Effect of temperature and pH on liquid viscosity

由圖1可知，隨著pH的降低，發(fā)酵液粘度顯著減少，20℃，pH2.0時，發(fā)酵液的粘度僅為0.29Pa·s。這是由于在酸性溶液中，γ-PGA的分子構象為規(guī)則的β片層結構，在中性環(huán)境中為無規(guī)則卷曲狀，而在堿性環(huán)境中為卷曲螺旋的隨機構造[13]。在較低pH下，細胞間的電荷排斥作用減少，γ-PGA與水分子相互作用減弱發(fā)生聚集，從而實現菌液分離，縮短離心時間，降低能耗[14]。同一pH條件下，隨著溫度升高，發(fā)酵液粘度降低，這是由于水分子獲得了較高的熱能，消弱了γ-PGA分子間的束縛作用，同時溫度升高使得γ-PGA分子長鏈發(fā)生斷裂造成的。提高溫度或調節(jié)pH可以有效地降低發(fā)酵液粘度，有利于離心除菌體，溫度過低或者pH過低破壞了γ-PGA的分子結構，通過實驗結果可知，在室溫下酸化處理即能滿足有效降低發(fā)酵液粘度。pH＜3.0時，γ-PGA分子易發(fā)生自身降解，實驗中采用稀鹽酸調pH至3.0，室溫靜置60min[15]，得到酸化液，用于后續(xù)工藝提取。

2.1.2 稀釋倍數對發(fā)酵液預處理的影響 比較離心和抽濾對菌體量、蛋白含量的影響，實驗結果見圖2～圖4。

圖2 抽濾和離心對發(fā)酵液中菌體量的影響Fig.2 Effect of suction filter and centrifugal bacterium on the bacteria volume

圖3 抽濾和離心對發(fā)酵液中蛋白含量的影響Fig.3 Effect of suction filter and centrifugal on protein content in the fermented liquid

圖4 不同稀釋倍數對γ-PGA回收率的影響Fig.4 The influence of different diluted multiples of γ-PGA recovery rate

由圖2可知，不稀釋或稀釋倍數較小時，抽濾除菌率比離心除菌率要高很多，因為發(fā)酵液較粘稠，致使菌體和γ-PGA纏繞在一起，離心時，菌體不易被離心。但當稀釋體積超過原體積4倍時，發(fā)酵液粘度下降，抽濾和離心除菌的效果相差不大。

從圖3可知，用涂有硅藻土涂層的抽濾裝置進行抽濾時，能夠除去發(fā)酵液中大部分蛋白，而離心僅能除去一小部分蛋白，并且離心不適合用于工業(yè)化大規(guī)模生產，難以實現徹底的菌液分離且雜蛋白很難有效被除去，因此，我們將選用抽濾來進行發(fā)酵液預處理。

由圖4可知，發(fā)酵液不稀釋時，γ-PGA濃度較高，分子間容易相互纏繞，容易被截留在硅藻土涂層上，導致回收率較低，隨著稀釋倍數的增加，發(fā)酵液粘度降低，雖有利于菌液分離，但是γ-PGA回收率不高。發(fā)酵液酸化后再進行稀釋，為原體積2倍時，回收率達到最高為74.1%，因此最佳稀釋倍數為原體積兩倍。

2.1.3 pH對抽濾的影響 隨著pH降低，發(fā)酵液粘度逐漸下降。由圖5可知，除菌率和除雜蛋白率隨pH下降而逐漸上升，這是因為粘度低的發(fā)酵液有利于菌液分離，徹底的除去菌體和雜蛋白。pH＜3.0時，γ-PGA的損失較多，回收率較低，γ-PGA的等電點為3.47附近，pH＜3.0時，γ-PGA分子結構遭到破壞。而pH＞3.5時，回收率也下降，一方面是因為在γ-PGA的等電點附近，其溶解度小，容易被硅藻土吸附，另一方面是因為發(fā)酵液粘度較大，γ-PGA分子容易纏繞而易被截留在硅藻土涂層上。因此，最佳pH為3.0，γ-PGA回收率為87.89%。

圖5 pH對γ-PGA發(fā)酵液預處理的影響Fig.5 The impact of pH on the pretreatment of gamma-PGA fermented liquid

2.1.4 硅藻土用量對發(fā)酵液預處理的影響 硅藻土是常用的吸附劑，能有效除去發(fā)酵液中菌體和雜蛋白。由表1可知，離心雖然能分離菌體，降低發(fā)酵液濁度，但經過鏡檢發(fā)現除菌并不徹底，并且離心不能有效除去發(fā)酵液中的雜蛋白。加入硅藻土作為吸附劑顯著降低了發(fā)酵液濁度和雜蛋白含量，因為硅藻土在攪拌過程中充分與發(fā)酵液接觸且容易沉積形成密實的硅藻土涂層，有利于發(fā)酵液中菌體截留和雜蛋白吸附。從結果上看，隨著硅藻土濃度增加，對菌體和雜蛋白的影響并不是很顯著，基本處在較低的恒定的水平。但是硅藻土濃度增加對γ-PGA回收率有一定影響，添加過多，將引起回收率下降，因此選擇10g/L硅藻土作為吸附劑，γ-PGA回收率可達99.1%。

表1 不同濃度的硅藻土對發(fā)酵液預處理的影響Table.1 The influence of different concentrations of diatomite in fermented liquid pretreatment

2.1.5 粉末活性炭和顆?；钚蕴繉Πl(fā)酵液預處理的影響 活性炭種類和濃度對菌體量吸附、雜蛋白去除及γ-PGA回收率的影響，實驗結果見表2。

表2 粉末活性炭和顆?；钚蕴繉Πl(fā)酵液預處理的影響Table.2 Effect of powder activated carbon and granular activated carbon on fermenting liquid pretreatment

由表2可知，顆?；钚蕴勘确勰┗钚蕴棵撋Ч院茫鼜氐?。但當活性炭濃度均為15g/L時，粉末活性炭γ-PGA回收率最高，達到99.6%；而顆?；钚蕴吭跐舛葹?0g/L時，γ-PGA回收率最高，達到99.2%。與表1進行對比可知，加了活性炭的發(fā)酵液經抽濾除菌效果比不加活性炭的明顯要好很多，發(fā)酵液非常透明澄清，而加了硅藻土的發(fā)酵液經過抽濾，濾液中雜蛋白含量比不加硅藻土處理的明顯少很多，因此，硅藻土對雜蛋白的吸附有顯著效果，而活性炭對菌體和雜質的吸附也具有顯著效果。

2.1.6 硅藻土和活性炭對發(fā)酵液預處理的影響 由之前的實驗結果可知，硅藻土的濃度對γ-PGA回收率的影響不是很顯著，而活性炭的用量對γ-PGA回收率有較大的影響，因此合適用量的活性炭對預處理很關鍵，實驗結果見表3。

表3 硅藻土濃度為10g/L時活性炭對發(fā)酵液預處理的影響Table.3 Effect of activated carbon on fermenting liquid pretreatment when the concentration of diatomaceous earth is 10g/L

由表3可知，在硅藻土濃度為10g/L時，活性炭濃度過高對發(fā)酵液影響較大，γ-PGA損失較多。粉末活性炭濃度為10g/L時，γ-PGA回收率為98.9%；顆粒活性炭濃度為15g/L時，γ-PGA回收率為99.4%?；钚蕴康挠昧砍^10g/L時，對菌體量和雜蛋白含量影響并不顯著，因此，在硅藻土和活性炭配合使用時，將硅藻土和粉末活性炭（顆?；钚蕴浚┯昧糠謩e定為10g/L和10g/L（15g/L）。

2.2 γ-PGA醇析和鹽析

由表4可知，當NaCl添加量相同時，乙醇用量不同會得到不同形態(tài)γ-PGA粗品，乙醇量過多，將會導致γ-PGA呈絮狀析出，乙醇量過少，γ-PGA無法析出。因此，可以通過控制乙醇量選擇生產需要的形態(tài)γ-PGA粗品。不加入NaCl時，得到顆粒狀γ-PGA粗品需要三倍體積乙醇，而隨著NaCl濃度增加，所需乙醇用量也逐漸減少，NaCl濃度超過5%時，只需一倍體積乙醇就能得到顆粒狀γ-PGA粗品，大大節(jié)省了乙醇用量，降低了生產成本。

2.3 γ-PGA粗品性狀分析

用鹽析和醇析方法析出γ-PGA后，經過處理，γ-PGA粗品回收率可達90%左右，所得到的γ-PGA粗品為白色的顆粒狀，吸水性極強，其水溶液無色無味。經過硅藻土和活性炭預處理，γ-PGA粗品水溶液中雜蛋白、多糖等雜質含量較少，均小于5%，幾乎不含菌體。隨著NaCl濃度增加，乙醇用量顯著減少，當NaCl濃度超過5%，乙醇用量基本處于穩(wěn)定。繼續(xù)加大NaCl濃度，將不會顯著減少乙醇用量。NaCl和乙醇用量不同，得到的γ-PGA粗品的性狀也會有所差異，γ-PGA粗品性狀分析見表5。

表4 不同用量的乙醇和NaCl對γ-PGA產物形態(tài)的影響Table.4 Effect of different dosage of ethanol and NaCl on γ-PGA product forms

表5 γ-PGA粗品性狀分析Table.5 Analysis of the characteristics of γ-PGA

由表5可知，相同形態(tài)γ-PGA粗品中，γ-PGA提取率和純度、多糖和雜蛋白含量略有差異，可能跟NaCl濃度有關系。不加NaCl，得到顆粒狀γ-PGA粗品需要三倍體積乙醇，提取率和純度均只有86.24%和88.49%，而5%NaCl和一倍體積乙醇提取γ-PGA，提取率和純度最高，分別為95.21%和96.89%。γ-PGA粗品純度和提取率有所提高，而且大大降低了乙醇用量，節(jié)約了工業(yè)成本和后續(xù)回收費用。

3 結論

采用稀釋和酸化發(fā)酵液減低體系粘度，利用硅藻土和活性炭吸附發(fā)酵液中的菌體和雜蛋白等，用抽濾的方法替代離心，有效實現了菌液分離、脫色和雜蛋白去除。最佳稀釋倍數為2倍，硅藻土和粉末活性炭（顆?；钚蕴浚┯昧糠謩e定為10g/L和10g/L（15g/L），在室溫下抽濾最佳pH為3.0。

利用鹽析和醇析的結合，5%NaCl和一倍體積乙醇提取γ-PGA，經過冷凍真空干燥可得到白色顆粒狀γ-PGA粗品，提取率為95.21%，純度可達96.89%。相對于傳統的提取工藝，本實驗提取所需乙醇用量僅為一倍體積，大大降低了乙醇用量，節(jié)約了生產成本，為大規(guī)模工業(yè)化生產打下了堅實的基礎。

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Pretreatment and purification of poly-γ-glutamic acid from fermentation broth

HE Yang-yang1，2，ZENG Wei1，2，WANG Qing-long1，2，CHEN Gui-guang1，2，LIANG Zhi-qun1，2，*
（1.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.State Key Laboratory for Conservation and Utili Zation of Subtropical Agro-bioresources，Guangxi University，Nanning 530004，China）

By using alcohol precipitation and salting out to extract γ-PGA.The best dilution multiples was 2 times，the dosage of diatomaceous earth and powder activated carbon（granular activated carbon），respectively，10g/L and 10g/L（15g/L），the best pH value was 3.0 for suction filter under the room temperature.Using 5% NaCl and double volume of ethanol for extraction of γ-PGA，by frozen vacuum drying of γ-PGA，the sample was white and granular，extraction efficiency achieved 95.21%，purity was 96.89%，using this method，the production input had reduced and the dosage of ethanol also highly reduced.

poly-γ-glutamic acid；pretreatment；diatomaceous earth；activated carbon；extract

TS201.3

A

1002-0306（2014）06-0156-05

2013－07－16 *通訊聯系人

賀楊揚（1989-），女，碩士研究生，研究方向：微生物工程、基因工程菌構建和酶工程。

國家自然科學基金項目（21062001）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項目（YCBZ2012004）。