蛋白溶解性分析法研究大米焙炒過程中蛋白質(zhì)熱變性行為

陳建新，徐　　巖

（1．江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2．江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3．江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

蛋白溶解性分析法研究大米焙炒過程中蛋白質(zhì)熱變性行為

陳建新1，2，徐巖1，3，*

（1．江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2．江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇無錫214122；3．江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

考察了焙炒過程中大米蛋白質(zhì)的熱變性行為，通過大米蛋白在不同功能溶劑中的溶解度變化了解大米蛋白質(zhì)在焙炒過程中次級結(jié)構(gòu)的變化及熱變性信息。發(fā)現(xiàn)熱變性主要發(fā)生在焙炒的前期，熱變性包括蛋白質(zhì)次級結(jié)構(gòu)的變化和更高能級的化學(xué)變化。與傳統(tǒng)蒸煮方法相比，焙炒大米的蛋白質(zhì)熱變性程度較低。粳米和糯米中的蛋白質(zhì)熱變性行為基本相似，選用不同的加熱介質(zhì)對大米蛋白的熱變性沒有影響。

焙炒，蛋白提取，大米，熱變性，蛋白溶解性

黃酒釀造時，需要將大米中的淀粉糊化和糖化最終變成葡萄糖。傳統(tǒng)的大米糊化方法是先浸泡后蒸飯。為了節(jié)能和減污，空氣或過熱蒸汽焙炒被用于大米的糊化[1-5]。在大米熱加工過程中，大米中的蛋白質(zhì)也同時發(fā)生了熱變性。熱變性蛋白更易水解成黃酒中的營養(yǎng)和風(fēng)味成分。

蛋白質(zhì)變性實際上是它的立體構(gòu)象由于外界因素的作用發(fā)生了改變，這種變化并沒有破壞蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，而是蛋白質(zhì)的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果。通常由于蛋白質(zhì)構(gòu)象改變后，一些活躍的基團會暴露，引起蛋白分子間的相互作用形成凝膠等，蛋白質(zhì)變性會造成蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，包括物理和化學(xué)性質(zhì)[6]。常用蛋白質(zhì)熱變性研究的手段主要包括結(jié)構(gòu)分析和熱力學(xué)分析，其中，結(jié)構(gòu)分析的方法有X射線衍射法、圓二色譜法、熒光光譜法和傅立葉紅外光譜法等[7]，熱力學(xué)分析主要是利用差示掃描量熱法分析變性過程熱力學(xué)參數(shù)變化[8]。另外，也可以通過蛋白溶液消光系數(shù)隨溫度的變化研究蛋白質(zhì)熱變性[9-10]。

上述研究方法有一個共同的缺點是只能用于提純蛋白質(zhì)熱變性研究。蛋白質(zhì)溶解性分析可以直接研究大米中蛋白質(zhì)的變性行為，蛋白質(zhì)提取劑是含有不同溶質(zhì)的緩沖液，針對蛋白質(zhì)次級結(jié)構(gòu)中不同的弱化學(xué)鍵。蛋白質(zhì)在不同提取劑中的溶解度變化可以反映蛋白質(zhì)次級結(jié)構(gòu)變化的信息，進(jìn)而可以了解蛋白質(zhì)的變性行為。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大米原料一種粳米，一種糯米，均來自中國江蘇宜興市糧油集團大米有限公司，收獲于2009年，經(jīng)過碾米加工，在-20℃條件下保存待用；磷酸緩沖液（PB，pH7.5）、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、曲拉通（Trionx-100）、3-（（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基）-1-丙磺酸（CHAPS）、濃硫酸、過氧化氫、硫酸銅、硫酸鉀、硒粉、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250均為分析純，均購自國藥集團。

玻璃凱氏定氮儀國藥集團；1-15PK型離心機德國西格瑪公司；F6/10型高剪切分散乳化機上海弗魯克流體機械公司；UV2000型分光光度計尤尼柯儀器有限公司；JFSD-100型粉碎機上海嘉定糧油檢測儀器廠；焙炒流化床自制；BCD-155TDGA型冰箱青島海爾股份有限公司；Free ZONE 2.5凍干機美國LABCONCO公司。

1.2大米焙炒

在流化床中分別采用過熱蒸汽，空氣在200℃下焙炒，焙炒時間分別是5、10、20、30、40s。焙炒大米經(jīng)過粉碎機粉碎后，過80目篩，分裝于密封袋中，在干燥器中保存。

1.3大米蒸煮

原料大米分別浸泡1、7d，然后在常壓下蒸汽蒸飯30min，蒸煮后立刻放冰箱-20℃冷凍24h，再經(jīng)過真空冷凍干燥，最后粉碎，過80目篩，分裝于密封袋中于干燥器中保存。

1.4蛋白質(zhì)提取劑系統(tǒng)及提取方法

根據(jù)表1配制不同的提取劑用于大米蛋白質(zhì)的溶解。根據(jù)溶質(zhì)的功能和組成，將提取劑分為兩個系統(tǒng)，單一組分系統(tǒng)和IEF緩沖液系統(tǒng)。

表1　蛋白質(zhì)提取劑配制表Table.1　Composition of protein extraction agent

稱取50mg米粉，加入提取劑10mL，用手持式攪拌機攪拌3min，提取2h后離心（16000r/min，15min），離心后的提取液測定蛋白質(zhì)濃度。

1.5大米中總蛋白含量測定

凱氏定氮法[11]。

1.6提取液中蛋白質(zhì)濃度測定

1.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用超純水配制100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)BSA（牛血清蛋白）溶液。以超純水作為實驗緩沖液，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mL標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液，分別加入1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2mL蒸餾水中，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。每份標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液中分別加入5mL考馬斯G-250溶液（考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%H3PO4，加蒸餾水稀釋至1000mL），翻轉(zhuǎn)搖勻，3～5min后，依次測標(biāo)準(zhǔn)樣品在595nm下的A值（以蛋白質(zhì)含量為0的做參比），每個標(biāo)樣重復(fù)3次讀數(shù)，取其平均值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)（μg/mL），吸光度為縱坐標(biāo)（y，A595），作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.6.2提取液中蛋白質(zhì)濃度測定取1.4所得的離心提取液0.5mL，加水混合至1mL，再加5mL考馬斯藍(lán)G-250 5mL，3min后，測595nm下樣品的A值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白質(zhì)含量。

式中，V—提取液體積，mL；cE—提取液蛋白質(zhì)濃度，μg/mL；n—提取液稀釋倍數(shù)；m—樣品質(zhì)量，mg；cRP—大米樣品總蛋白質(zhì)含量，μg/mg。

圖1　提取液蛋白質(zhì)濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Fig.1　Standard curve and regression equation ofprotein concentration of extract

2　結(jié)果與討論

2.1單一組分系統(tǒng)提取大米中的蛋白質(zhì)

大米總蛋白含量的測定結(jié)果，粳米總蛋白質(zhì)含量91μg/mg，糯米總蛋白質(zhì)含量79μg/mg。提取液中蛋白質(zhì)濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程均在圖1中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.99，可以滿足檢測要求。測定的提取液蛋白質(zhì)濃度代入式（1）即可求得大米蛋白質(zhì)提取率。

單一組分系統(tǒng)選取的提取劑的作用分別是：PB緩沖液提取原生狀態(tài)蛋白質(zhì)；尿素和硫脲主要破壞非共價鍵（氫鍵，疏水鍵）；DTT破壞二硫鍵；Triton X-100，CHAPS破壞疏水鍵[12-13]。通過測定在不同提取劑中的溶解度，可以了解大米蛋白質(zhì)在加熱過程中次級結(jié)構(gòu)的變化信息。

圖2　單一組分提取系統(tǒng)粳米蛋白提取率Fig.2　Rice protein extraction rate by single component extraction system

圖3　單一組分提取系統(tǒng)糯米蛋白提取率Fig.3　Glutinous rice protein extraction rate by single component extraction system

圖2～圖3分別是粳米和糯米在過熱蒸汽和空氣中焙炒大米的蛋白提取率，磷酸緩沖液提取自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)，因此，提取率非常低。其他五種物質(zhì)中，除了尿素有較高的提取率外，其他幾種溶劑僅略高于磷酸緩沖液的提取能力。說明大米中的蛋白質(zhì)中未有對次級結(jié)構(gòu)起決定作用的弱化學(xué)鍵，因此，認(rèn)為大米蛋白質(zhì)的次級結(jié)構(gòu)受多種弱化學(xué)鍵共同影響，任何單一的溶劑無法大幅度提高蛋白質(zhì)的提取率。

尿素對促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解有比較顯著的效果，其機理主要是打破氫鍵和疏水鍵，說明氫鍵和疏水鍵在大米蛋白的次級結(jié)構(gòu)中起比較重要的作用，是保持大米的自然狀態(tài)的主要弱化學(xué)鍵。大米蛋白質(zhì)在尿素中的溶解度在焙炒初期急劇下降，焙炒中期后不再發(fā)生變化，說明大米蛋白熱變性的過程主要發(fā)生在焙炒初期，熱變性過程時大米蛋白質(zhì)中的氫鍵和疏水鍵同樣也發(fā)生了較大的變化。

2.2IEF緩沖液提取大米中的蛋白質(zhì)

圖4、圖5分別是用IEF提取系統(tǒng)提取焙炒粳米和糯米蛋白的提取率。從總體上看，提取率顯著高于單一組分系統(tǒng)，說明需要提取劑中多組分同時破壞蛋白質(zhì)中不同的弱化學(xué)鍵，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)才能發(fā)生變化，并溶解于溶劑中。IEF緩沖液提取系統(tǒng)與單一組分提取系統(tǒng)的最大區(qū)別是尿素的作用。在單一組分中，尿素的效果比較顯著，但在IFE提取系統(tǒng)中，尿素的作用并不突出。反之，DTT的作用卻相對比較大，缺少DTT的IEF緩沖液大米蛋白質(zhì)的提取能力顯著下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的可能原因：IEF緩沖液組分中，硫脲、曲拉通、CHAPS的作用與尿素相似，具有較強的互補性，因此，缺少尿素的IEF緩沖液仍然具有較強的大米蛋白提取能力。DTT的作用是破壞二硫鍵，并且在IEF的組分中只有DTT具備這種能力，因此，如果缺少DTT，IEF緩沖液無法破壞二硫鍵，大米蛋白質(zhì)溶解能力隨之大幅下降。比較在單一組分系統(tǒng)中，DTT溶液提取蛋白質(zhì)的能力并不強，說明DTT只有在打破氫鍵等前提下才能發(fā)揮作用，因此，與尿素或其他相似功能的物質(zhì)共同使用才能提高蛋白質(zhì)提取能力。反之，硫脲、曲拉通、CHAPS也只有與DTT協(xié)同作用時才表現(xiàn)破壞氫鍵和疏水鍵的能力。因此，多組分協(xié)同作用是提取劑提高蛋白質(zhì)提取率的關(guān)鍵。

與單一組分系統(tǒng)相同，大米蛋白質(zhì)的提取率在焙炒前期變化很大，中后期基本不變，大米蛋白質(zhì)的熱變性主要發(fā)生在焙炒前期。說明大米蛋白對溫度比較敏感，而加熱時間對蛋白的變性影響不大。含水率可能對大米蛋白質(zhì)的變性也有重要影響，焙炒時大米的水分不斷蒸發(fā)減少，含水量由初始時的約14%降低到最終的4%左右[4]。在焙炒初期，大米的溫度并不高，但含水率相對較大，而在中后期大米的溫度比較高但含水率比較低。而受熱時蛋白的含水率對蛋白是否發(fā)生熱變性以及變性的程度有影響。

蛋白質(zhì)的熱變性一般屬于次級結(jié)構(gòu)改變，但隨焙炒的進(jìn)程，大米蛋白質(zhì)在IEF緩沖液中的溶解度由約70%降低到約40%，說明部分蛋白質(zhì)的變性不僅是次級結(jié)構(gòu)中的弱化學(xué)鍵發(fā)生了變化，還發(fā)生了更高能級的化學(xué)變化，形成新的化學(xué)鍵或者蛋白質(zhì)與大米中的其他成分結(jié)合成復(fù)合物等，總之，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變超出了次級結(jié)構(gòu)的變化范圍。

圖4　IEF緩沖液提取系統(tǒng)粳米蛋白提取率Fig.4　Rice protein extraction rate by IEF buffer extraction system

圖5　IEF緩沖液提取系統(tǒng)糯米蛋白提取率Fig.5　Glutinous rice protein extraction rate by IEF buffer extraction system

3　討論

與傳統(tǒng)的濕熱加工方式相比，焙炒大米中蛋白的變性程度相對較低，而傳統(tǒng)的加工方式中，浸泡時間長的大米蛋白質(zhì)變性程度更高。這種現(xiàn)象值得關(guān)注，因為焙炒是高溫、短時和低水分含量而傳統(tǒng)的蒸煮是低溫、長時間和高水分含量。這進(jìn)一步印證了水分對蛋白熱變性的促進(jìn)作用[6]，并且長時間浸泡使大米的微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，蛋白質(zhì)更容易發(fā)生熱變性。

比較糯米和粳米中蛋白質(zhì)溶解度，兩者之間存在差異，這種差異是兩種大米在微觀結(jié)構(gòu)和所含淀粉分子差異造成的。比較發(fā)現(xiàn)，過熱蒸汽和空氣對焙炒大米蛋白變性的影響不大，無論采用什么樣的加熱介質(zhì)，關(guān)鍵是加熱介質(zhì)對大米自身的溫度和溫度變化產(chǎn)生的影響，如果介質(zhì)的加熱效果相同，那么大米蛋白的熱變性也就相同，與所采用加熱介質(zhì)種類無關(guān)，僅與大米自身的溫度變化有關(guān)。

4　結(jié)論

4.1大米焙炒過程中，大米蛋白的熱變性發(fā)生在焙炒前期，并且變性程度較高，除了次級結(jié)構(gòu)被改變以外，還有能級更高的化學(xué)鍵的變化。

4.2盡管焙炒溫度較高，但焙炒大米的蛋白質(zhì)變性程度低于傳統(tǒng)的浸泡蒸煮大米，并且粳米與糯米的變性過程和程度基本相同，使用不同的加熱介質(zhì)對大米蛋白的變性沒有影響。

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Analysis of the thermal denaturation of rice protein during roasting by protein solubility study

CHEN Jian-xin1，2，XU Yan1，3，*
（1．Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2．National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3．School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Thermal denaturation of rice protein during roasting was examined in this paper.The information about the changes of secondary structure of rice protein and thermal denaturation of rice protein was known through the solubility of rice protein changes in different solvents.It was found that the thermal denaturation occurred mainly in the early stage of roasting and thermal denaturation involved the change of protein secondary structure and the higher energy level chemical changes.Compared with the traditional cooking methods，roasted rice protein thermal denaturation degree was low.Protein denaturation degree of waxy rice and no waxy rice was similar during roasting and the effect of thermal denaturation of rice was the same using different heating medium.

roasting；protein extraction；rice；thermal denaturation；protein solubility

TS262.4

A

1002-0306（2014）06-0132-05

2013－08－02*通訊聯(lián)系人

陳建新（1965－），男，大學(xué)本科，高級工程師，研究方向：釀酒機械化。