N、P調(diào)控外源Se、Zn對(duì)茶葉元素含量及抗氧化能力的影響

楊婷婷，鄧澤元，，胡小飛，陳伏生，范亞葦，劉 蓉，*

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)高等研究院，江西南昌330047）

N、P調(diào)控外源Se、Zn對(duì)茶葉元素含量及抗氧化能力的影響

楊婷婷1，鄧澤元1，2，胡小飛1，陳伏生2，范亞葦1，劉 蓉1，*

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)高等研究院，江西南昌330047）

選取以江西為代表的丘陵紅壤區(qū)生長(zhǎng)的茶樹作為研究對(duì)象，通過在土壤中添加外源Se、Zn并進(jìn)行N、P調(diào)控，研究一芽二葉和老葉中Se、Zn、Al、Mn四種元素含量、茶多酚含量以及茶葉抗氧化能力的變化。以期探尋在降低茶葉中Al、Mn含量的同時(shí)提高茶葉自然品質(zhì)的新種植方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過N、P調(diào)控外源Se、Zn進(jìn)行種植后，一芽二葉和老葉中Se、Zn含量升高，最多分別提高255.65%和100.45%；Al、Mn含量降低，最多分別降低39.27%和35.85%；茶多酚含量提高，并且抗氧化能力增強(qiáng)。

茶葉，元素，茶多酚，抗氧化

茶葉在中國的栽培歷史悠久，已成為全球三大無酒精飲料之一[1]。茶葉中含有豐富的礦物質(zhì)和多種生理活性物質(zhì)[2-3]，對(duì)人體健康有益[4]。然而茶樹易富集Al、Mn，致使茶葉中Al、Mn含量為其他植物中的幾倍至幾十倍。近年來酸雨加重，導(dǎo)致江西紅壤酸化加劇[5]，使土壤中N、P等元素含量降低且有效Al、有效Mn含量增加[6-7]，不僅對(duì)茶葉的自然品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[8-9]，還會(huì)使茶葉中的Al、Mn過量累積并通過茶湯進(jìn)入人體蓄積，具有引發(fā)老年癡呆癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性中毒的潛在風(fēng)險(xiǎn)[10-12]。

Se、Zn對(duì)植物的生長(zhǎng)具有重要影響。Se可以促進(jìn)茶樹生長(zhǎng)，提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)[13]。Zn能促進(jìn)茶樹酶活性，增加有效Zn含量，對(duì)N和P的利用有催化作用[14]。 N、P也是茶樹生長(zhǎng)過程中不可或缺的元素，不僅影響茶樹的生長(zhǎng)和產(chǎn)量，對(duì)茶葉的品質(zhì)也有一定影響。研究表明，茶葉含N量與茶葉的氨基酸、茶多酚等主要生化成分密切相關(guān)[15]。施加P肥后，茶葉香氣和滋味均有提高[16-17]。

茶葉的品質(zhì)不但受到茶樹的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響，還受到土壤中各種元素間相互作用的影響。目前，外源元素對(duì)茶葉品質(zhì)影響的研究主要集中在利用單一元素水培或盆栽種植。但是，在大田種植條件下，多種元素共同作用對(duì)茶葉中Al、Mn含量及茶葉品質(zhì)影響的研究，迄今鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選取江西省蠶桑茶研究所茶樹良種繁育場(chǎng)為實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)，通過在土壤中添加Se、Zn并進(jìn)行N、P調(diào)控，探討不同施肥方式下茶葉中Se、Zn、Al、Mn四種元素含量的變化，以及茶多酚含量和抗氧化能力的變化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沒食子酸阿拉丁試劑公司；福林-酚試劑，1mol/L上海荔達(dá)生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH） 阿拉丁試劑公司；FRAP試劑盒碧云天試劑公司；測(cè)定元素含量時(shí)所用的玻璃儀器均用5%硝酸浸泡24h。

OPTIMA 5300DV型ICP-AES 美國PE公司；AFS-230E型原子熒光北京海光儀器公司；SP-1900UV型系列分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司；HHS11型恒溫水浴鍋北京醫(yī)用離心機(jī)廠；TDL-5-A型臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱南京實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1茶葉樣品的種植方法選取30年茶齡的福鼎大白共五個(gè)樣方（每個(gè)樣方大小為3m×4m），分別用五種施肥方法（A、B、C、D、CK）種植，每種方法所施的肥料分別為A：Se+Zn；B：Se+Zn+N；C：Se+Zn+P；D：Se+Zn+N+P；CK：水（作為空白對(duì)照）。其中，Se源和Zn源分別為Na2SeO3（21.9mg）、ZnSO4·7H2O（2.53g），N源和P源分別為NH4NO3（14.29g）、NaH2PO4（9.68g）。稱取相應(yīng)量的藥品溶于12L水中，直接噴施于土壤中。3月開始，每月施肥一次。本實(shí)驗(yàn)的茶葉樣品為同年11月份采摘的一芽二葉和老葉。

1.2.2茶葉元素含量的測(cè)定參考GB/T 5009.90－2003的方法[18]測(cè)定。取0.5g（精確到0.0001g）茶葉樣品于錐形瓶中，加入10.0mL混酸（硝酸∶高氯酸=4∶1），蓋上表面皿，靜置12h，在電熱板上加熱消化，至白煙冒盡，溶液為無色透明且剩余2～3mL時(shí)，待取下冷卻至室溫，過濾至25mL比色管，用超純水定容至25mL，待測(cè)。Zn，Al，Mn含量用ICP-AES測(cè)定，Se含量用原子熒光測(cè)定。

1.2.3茶葉粗提物的制備參考王飛飛等的方法[19-20]。稱取0.25g（精確到0.0001g）均勻磨碎的茶葉粉末于10mL試管中，加入預(yù)熱的50%乙醇溶液2.5mL，混勻后立即移入70℃水浴鍋中，浸提30min（每隔5min攪拌一次），冷卻至室溫后離心，上清液轉(zhuǎn)移至10mL比色管，對(duì)殘?jiān)M(jìn)行二次浸提，合并提取液并定容至5mL，搖勻。移取該提取液0.1mL至10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10mL并搖勻，即為茶葉粗提物的待測(cè)樣液。

1.2.4茶多酚含量的測(cè)定參考GB/T 8313-2008的方法[21]。取待測(cè)樣液、蒸餾水（作為空白對(duì)照）各1.0mL于刻度試管內(nèi)，分別加入5.0mL的福林-酚試劑，搖勻，反應(yīng)3～8min后，加入4.0mL 7.5%Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至10mL、搖勻，室溫下放置60min，在765nm處測(cè)定其吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算茶多酚含量。

1.2.5抗氧化能力的測(cè)定

1.2.5.1DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考胡喜蘭等的方法測(cè)定[22-23]。準(zhǔn)確吸取各待測(cè)樣液2.0mL，分別加入0.2mmol/L DPPH·乙醇溶液2.0mL，搖勻，避光靜置30min后，以無水乙醇做為對(duì)照，在517nm處測(cè)定吸光值。按照下式計(jì)算清除率。

式中：Ai—加入待測(cè)液的DPPH·乙醇溶液的吸光度；Aj—加入待測(cè)液的無水乙醇的吸光度；Ac—未加待測(cè)液的DPPH·乙醇溶液的吸光度。

1.2.5.2還原力的測(cè)定參照Oyaizu的方法測(cè)定[24]。取1.0mL待測(cè)樣液與2.5mL的磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）混合，加入1%鐵氰化鉀2.5mL，混合物于50℃恒溫20min，再加入1.0mL 10%三氯乙酸后離心。取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1%三氯化鐵0.5mL，混勻，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在700nm處測(cè)定吸光值。

1.2.5.3FRAP法的測(cè)定參考申迎賓的方法測(cè)定[25]。TPTZ稀釋液（0.1mol/L醋酸緩沖液，pH3.6）、TPTZ溶液（10mmol/L TPTZ）與檢測(cè)緩沖液（20mmol/L三氯化鐵）按10∶1∶1的比例混合，即為FRAP工作液。取3.6mL FRAP工作液與0.1mL各待測(cè)樣液混合，同時(shí)以蒸餾水做空白對(duì)照，在37℃水浴5min后，在593nm處測(cè)定吸光值。以不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？寡趸芰σ訤eSO4標(biāo)準(zhǔn)液的濃度來表示。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以p＜0.05判斷為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與討論

2.1茶葉元素含量的測(cè)定

經(jīng)不同施肥方法種植的茶葉中四種元素含量如表1所示。

一芽二葉和老葉中Se含量的順序均為：C＞D＞B＞A＞CK；與CK組相比，Se含量最多分別提高172.64%和255.65%。一芽二葉的B、C、D組與CK組、老葉各組與CK組之間分別具有顯著性差異。同時(shí)，老葉中各組Se含量均高于一芽二葉。

一芽二葉和老葉中Zn含量的順序均為：B＞A＞D＞C＞CK；與CK組相比，Zn含量最多分別提高46.47%和100.45%。老葉中各組與CK組均有顯著性差異，而一芽二葉中只有A、B組與CK組之間有顯著性差異。一芽二葉中的Zn含量均高于老葉。

一芽二葉和老葉中Al含量的順序均為：CK＞A＞B＞D＞C；與CK組相比，Al含量最多分別降低30.42%和39.27%。一芽二葉中僅C組與CK組有顯著性差異，而老葉各組與CK組之間均有顯著性差異。老葉的Al含量遠(yuǎn)高于一芽二葉。

一芽二葉中Mn含量的順序?yàn)椋篊K＞C＞D＞A＞B；與CK組相比，Mn含量最多分別下降12.94%和35.85%。A、B組與CK組之間有顯著性差異。老葉中Mn含量的順序與一芽二葉中一致，A、B、D組與CK組有顯著性差異。老葉中Mn含量遠(yuǎn)高于一芽二葉。

2.2茶多酚含量的測(cè)定

茶多酚含量如圖1所示。結(jié)果表明，一芽二葉的茶多酚含量高于老葉。四種施肥方式種植后，一芽二葉和老葉中的茶多酚含量均增加，順序?yàn)椋篊＞D＞B＞A＞CK，C組的茶多酚含量最高，分別為31.5%和30.1%，和CK組相比具有顯著性差異。由于施P能促進(jìn)茶多酚的合成[9]，所以使用Se+Zn+P種植，能有效提高茶葉中茶多酚含量。

2.3抗氧化能力的測(cè)定

2.3.1DPPH自由基清除能力的測(cè)定DPPH自由基是一種穩(wěn)定的質(zhì)子自由基，因其具有單電子而在517nm處有強(qiáng)吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)而使特征吸收逐漸消失。測(cè)定結(jié)果如圖2所示。

表1　一芽二葉和老葉Se、Zn、Al、Mn四種元素含量Table.1　Content of Se，Zn，Al and Mn in two leaves and a bud，and old leaves

圖1　一芽二葉和老葉茶多酚含量Fig.1　Total phenolic content（TPC，%）of two leaves and a bud，and old leaves

圖2　一芽二葉和老葉的DPPH自由基清除能力Fig.2　DPPH radical-scavenging activity（DPPH，%）of two leaves and a bud，and old leaves

四種施肥方式種植后，一芽二葉與老葉對(duì)DPPH自由基的清除能力與CK組相比，均顯著增強(qiáng)，順序均為：C＞D＞B＞A＞CK，C組對(duì)DPPH自由基的清除率最高，分別為96.5%和90.7%。一芽二葉A、B、C、D各組清除DPPH自由基能力均高于老葉，清除率均高達(dá)90%以上。

2.3.2還原力的測(cè)定測(cè)定還原力的實(shí)質(zhì)是檢驗(yàn)抗氧化物質(zhì)是否為良好的電子供應(yīng)者。以普魯士藍(lán)的生成量為指標(biāo)，吸光值越大則抗氧化能力越強(qiáng)。結(jié)果如圖3所示。一芽二葉和老葉的還原力強(qiáng)弱順序均為：C＞D＞B＞A＞CK，B、C、D組與CK組之間均具有顯著性差異。

圖3　一芽二葉和老葉的還原力Fig.3　Reduction capabilities of two leaves and a bud，and old leaves

2.3.3FRAP的測(cè)定FRAP反應(yīng)屬于單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，F(xiàn)e3+-三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被還原性物質(zhì)還原為Fe2+，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并于593nm處具有最大光吸收。結(jié)果如圖4所示。一芽二葉的FRAP值順序?yàn)椋篊＞B＞D＞A＞CK，B、C組與CK組之間具有顯著性差異，老葉的FRAP值順序與一芽二葉一致，各組與CK組之間均具有顯著性差異。

2.4討論

和CK組相比，四種不同的施肥方式均可提高茶葉中Se、Zn的含量，而降低茶葉中Al、Mn的含量。其中，C組，即使用Se+Zn+P種植組，茶葉中Se含量的增加、Al含量的降低最為顯著；而對(duì)于茶葉中Zn、Mn含量的影響則最小。而B組，即使用Se+Zn+N種植組，對(duì)提高茶葉中的Zn含量、降低Mn含量的效果最明顯?？赡苁荘降低了土壤顆粒表面Se的吸附量，使土壤解析出更多的Se離子供植物吸收，因而顯著提高茶葉Se的含量[26]。N能顯著提高茶葉中Zn的含量，可能是因?yàn)镹會(huì)促進(jìn)植物根系對(duì)Zn的吸收與Zn在植物體內(nèi)的累積[27]。相關(guān)性分析表明，Zn和Mn、Se與Al分別存在顯著負(fù)相關(guān)，推斷Zn與Mn、Se與Al可能分別存在拮抗作用。茶葉中的含Se量會(huì)隨新梢的老化而增加，所以，不同施肥方式種植的老葉都比一芽二葉的Se含量稍高[28]。

圖4　一芽二葉和老葉的FRAP值Fig.4　Ferric reducing antioxidant power（FRAP，mmol/g）of two leaves and a bud，and old leaves

茶多酚含量及三種抗氧化能力測(cè)定結(jié)果表明，土壤中添加Se、Zn并進(jìn)行N、P調(diào)控后，茶葉的抗氧化能力均有所提高，相應(yīng)的，其茶多酚含量也有所增加?？赡苁㏄對(duì)提高茶葉中茶多酚含量具有一定的促進(jìn)作用，所以C組，即Se、Zn、P共施種植后，茶葉中茶多酚含量最高，其抗氧化能力也最強(qiáng)。茶多酚作為茶葉中的主要抗氧化物質(zhì)[29]，其含量的增加可能是茶葉抗氧化能力增強(qiáng)的主要因素。

3　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，通過土壤添加外源Se、Zn及N、P調(diào)控，可以使茶葉中Se、Zn含量增加，最多分別提高255.65%和100.45%；而Al、Mn含量減少，最多分別降低39.27%和35.85%，從而提高茶葉的品質(zhì)。

施N、P有利于提高茶葉中Zn、Se的含量。Se、Zn、P共施對(duì)提高茶葉中Se含量的作用最明顯，而增加茶葉Zn含量則以Se、Zn、N共施為佳。Zn與Mn、Se與Al之間可能分別存在拮抗作用。

通過土壤添加外源Se、Zn及N、P調(diào)控，茶葉中茶多酚含量與抗氧化能力均有所提高，其中，Se、Zn、P共施效果最顯著。

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Effect of N and P regulating exogenetic Se and Zn on elements content and antioxidant ability in tea

YANG Ting-ting1，DENG Ze-yuan1，2，HU Xiao-fei1，CHEN Fu-sheng2，F(xiàn)AN Ya-wei1，LIU Rong1，*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Life Science and Institute for Advanced Study，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Tea，planted in Jiangxi province which was representation of hilly red soil region，was selected as research objects.By adding exogenetic Se and Zn which were regulated by N and P in soil，variation of Se，Zn，Al and Mn content，total phenolic content，as well as antioxidant ability in two leaves and a bud and old leaves were investigated.A new plant method which could decrease the content of Al and Mn and improve the natural quality of tea was expected to be explored.The results showed that the content of Se and Zn increased，which the highest growth rate respectively were 255.65%and 100.45%，while the content of Al and Mn decreased which the highest reduction rate were 39.27%and 35.85%through soil regulation.Moreover，the total phenolic and antioxidant ability of the tea increased.

tea；elements；tea polyphenol；antioxidant ability

TS272.5

A

1002-0306（2014）06-0125-05

2013－07－22*通訊聯(lián)系人

楊婷婷（1987-），女，碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與保健功能食品。

國家自然科學(xué)地區(qū)基金（31060081）。