陜西平利絞股藍(lán)氨基酸類成分指紋圖譜研究

陳培云，貢東軍，趙志磊，龐艷蘋

（河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北保定071002）

陜西平利絞股藍(lán)氨基酸類成分指紋圖譜研究

陳培云，貢東軍，趙志磊，龐艷蘋

（河北大學(xué)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督學(xué)院，河北保定071002）

采用柱前衍生高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對(duì)陜西平利絞股藍(lán)中氨基酸類成分的指紋圖譜進(jìn)行研究。結(jié)果表明，以鄰苯二甲醛為柱前衍生試劑，Kromasil C18分離，流動(dòng)相為0.05mol/L醋酸鈉+0.5%四氫呋喃-甲醇，采用梯度洗脫，絞股藍(lán)中氨基酸類成分可得到良好的分離，同時(shí)對(duì)樣品中16種氨基酸的含量進(jìn)行定量；通過對(duì)13批樣品HPLC圖譜的分析，共確定22個(gè)色譜峰作為平利絞股藍(lán)的特征指紋峰，利用夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，13批陜西平利絞股藍(lán)指紋圖譜相似度0.989～1.00之間，該圖譜能綜合、準(zhǔn)確地反映陜西平利絞股藍(lán)氨基酸類成分的特征，為保護(hù)平利絞股藍(lán)原產(chǎn)地域產(chǎn)品提供了新的途徑。

絞股藍(lán)，氨基酸，指紋圖譜，陜西平利，高效液相色譜法

絞股藍(lán)又名七葉參，素稱南方人參，系葫蘆科多年生草質(zhì)藤本植物，絞股藍(lán)味苦、性寒。具有抑制腫瘤、降低血脂、清熱解毒、止咳酄痰等作用[1]。地處北亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)的平利縣，由于雨量充沛，氣候溫和，日照充足，無霜期時(shí)間長，土壤有害物質(zhì)含量低，成為中國國內(nèi)生態(tài)型藥用植物種植示范基地的最佳區(qū)域[2]。近年來隨著陜西平利絞股藍(lán)的名氣提升，價(jià)格也隨之提高，一些不法商販為了獲得利益，經(jīng)常將其他產(chǎn)地的絞股藍(lán)冒充原產(chǎn)地產(chǎn)品。而目前對(duì)于絞股藍(lán)品質(zhì)的鑒別還主要依靠感官審評(píng)的方法，導(dǎo)致的主觀性及不穩(wěn)定性，缺乏量化依據(jù)。指紋圖譜是隨著現(xiàn)代分析技術(shù)發(fā)展而誕生的一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)，是以各種光譜、波譜、色譜等技術(shù)為依托的又一種質(zhì)量控制模式[3]。通常得到的指紋圖譜相當(dāng)復(fù)雜，人工比較難免影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。若將其與計(jì)算機(jī)圖譜解析和識(shí)別技術(shù)結(jié)合起來，其應(yīng)用前景將大為擴(kuò)展[4-5]，利用色譜指紋圖譜技術(shù)在絞股藍(lán)研究中的應(yīng)用目前已有報(bào)道。主要集中于黃酮類的研究，對(duì)于絞股藍(lán)氨基酸的研究報(bào)道甚少。本文根據(jù)陜西平利地區(qū)絞股藍(lán)特有的特點(diǎn)，結(jié)合原產(chǎn)地保護(hù)及品質(zhì)控制需求，通過柱前衍生高效液相色譜法建立平利絞股藍(lán)氨基酸指紋圖譜，采用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件綜合運(yùn)用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦、中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行相似度分析，對(duì)陜西平利的絞股藍(lán)氨基酸類成分指紋圖譜方法進(jìn)行了探索研究，以期為陜西平利絞股藍(lán)的鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鄰苯二甲醛 分析純，上海源葉生物科技有限公司；β-巰基乙醇（amresco，分析純）、甲醇（色譜純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；四氫呋喃 分析純，上海同試化工有限公司；乙酸鈉 優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工廠；硼酸 ≥99.8%，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉 ≥98%優(yōu)級(jí)純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；氨基酸對(duì)照品：天冬氨酸（20121123）、蛋氨酸（20110415）、賴氨酸（20130113） 購自上海源葉生物科技有限公司；谷氨酸（14690-201203）、絲氨酸（14688-201001）、組氨酸（140693-201102）、甘氨酸（140689-201103）、蘇氨酸（140682-201102）、丙氨酸（140680-201002）、色氨酸（140686-201002）、纈氨酸（14681-201202）、苯丙氨酸（140676-201106）、異亮氨酸（140683-201202）、亮氨酸（140687-201102） 購自中國食品藥品檢定研究所；精氨酸（≥99.2%）、酪氨酸（≥99.4%） 購自中國計(jì)量科學(xué)研究院；實(shí)驗(yàn)用水 為Milli-Q超純水，流動(dòng)相以0.45μm的濾膜過濾；絞股藍(lán)樣品 購自陜西平利縣興強(qiáng)富硒茶業(yè)有限公司，共計(jì)購得2012年間出廠的規(guī)格為500g/包的絞股藍(lán)樣品50包，從中隨機(jī)抽取13包作為實(shí)驗(yàn)用材。

Agilent1100高效液相色譜儀 Agilent色譜工作站，色譜柱Kromasil C18，5μm，4.6mm×250mm，檢測器為Agilent G1321熒光檢測器，美國安捷倫科技公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；高速中藥粉碎機(jī) 武義縣屹立工具有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別精密稱取16種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸各0.25g于25mL容量瓶中，加超純水溶解并定容后備用。

1.2.2 供試樣品制備 絞股藍(lán)在50～60℃下烘干干燥，干燥后的材料用植物粉碎機(jī)粉碎并過80目篩，準(zhǔn)確稱取絞股藍(lán)0.6g，置于100mL容量瓶中，用二次去離子水至近刻度，30℃超聲提取30min（100kHz，80W），冷卻后，二次去離子水定容至刻度，10000r/min離心棄去沉淀，離心液用0.45μm濾膜過濾，備用。

1.2.3 衍生及分析 衍生試劑的配制：稱取0.27g鄰苯二甲醛（OPA）溶于5mL無水乙醇中，加入100μL 2-巰基乙醇，用0.4mol/L的硼酸（pH=9.5，氫氧化鈉溶液調(diào)制）定容到50mL，混勻，置于暗處，每隔1d補(bǔ)加10μL巰基乙醇，每周需重新配制。

移取100μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品于2mL的棕色樣品瓶中加入等量的OPA衍生化試劑，在混勻器中混勻，反應(yīng)1.5min，取50μL（定量環(huán)為20μL）注入高效液相色譜儀，按下述色譜條件操作，記錄30min色譜圖。

1.2.4 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18（4.6mm× 250mm，5μm），流動(dòng)相（A）：0.05mol/L醋酸鈉+0.5%四氫呋喃；流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫線性梯度：（T，B%）（0min，20%）（27min，88%）（34min，20%）。流速為1.0mL/min，柱溫為35℃，熒光檢測激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為460nm，進(jìn)樣量為20μL。每次樣品完成后，系統(tǒng)平衡10min。

1.2.5 方法的穩(wěn)定性及精密度 取樣品按上述方法分別在0、2、4、8、10、12、24h衍生進(jìn)樣，研究方法的穩(wěn)定性；取同一樣品5份，分別進(jìn)樣，研究方法的重復(fù)性；取1份樣品，連續(xù)6次進(jìn)樣，研究方法的精密度。

1.2.6 方法的準(zhǔn)確度 從同一來源的絞股藍(lán)樣品中取10份樣品，每份0.6g，其中9份平均分為3組，每組樣品分別加0.0096、0.064、0.16μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；剩余的1份樣品中加入與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積的水作為對(duì)照；按所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理及測定，考察16種氨基酸的加標(biāo)回收率。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)通過對(duì)樣品的制備、經(jīng)高效液相色譜分析后，對(duì)所有的數(shù)據(jù)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件以及SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測定氨基酸方法的建立及分析

2.1.1 供試品溶液的制備 比較了純水提取以及水提后乙酸鋅沉蛋白的方法提取絞股藍(lán)中游離氨基酸成分，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水提乙酸鋅沉蛋白的方法氨基酸的回收率過低，采用純水進(jìn)行浸泡、超聲、離心提取，操作較為簡單且出峰最穩(wěn)定，故選擇純水提取處理后直接衍生，并未對(duì)提取液進(jìn)行其他除雜處理。

2.1.2 衍生條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)衍生時(shí)間對(duì)氨基酸的峰面積有很大的影響。衍生時(shí)間太短，反應(yīng)不完全，衍生時(shí)間太長，氨基酸與衍生劑形成的化合物極易降解，因此在建立藥材指紋圖譜時(shí)必須嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間在1.5～2min之間。

2.1.3 HPLC色譜條件的優(yōu)化 本文在前人的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化改進(jìn)了色譜條件，使得16種氨基酸能在35min中內(nèi)完成，分離效果較好，詳見表1中的HPLC色譜洗脫梯度。

表1HPLC色譜洗脫梯度Table.1 The gradient elution for HPLC

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 方法的專屬性 在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，空白衍生試劑、標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品色譜圖見圖1～圖3，由圖可見氨基酸在26min內(nèi)基本達(dá)到了完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)及衍生化試劑不干擾氨基酸的測定。方法具有較好的專屬性。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各主要色譜峰的相對(duì)丙氨酸參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.10%～0.32%、0.28%～3.3%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一絞股藍(lán)5份，分別進(jìn)樣，結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)丙氨酸參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別0.2%～1.5%、0.26% ～3.5%，表明本方法重復(fù)性好。

圖1 空白衍生試劑色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of derivatization reagent

圖2 16種氨基酸對(duì)照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 16 amino acids compounds standards

圖3 絞股藍(lán)水提取液色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of Gynostemma pentaphylla

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一絞股藍(lán)供試品溶液，分別在0、2、4、8、10、12、24h衍生進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果各主要色譜峰相對(duì)丙氨酸參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別為0.58%～2.65%、0.69% ～2.39%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.3 線性分析

分別精密吸取不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)柱前衍生化后，分別進(jìn)樣分析，以氨基酸溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)、以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍為0.0032～8mg·L-1，16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)的線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明16種氨基酸在所測濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣濃度和峰面積具有良好的線性關(guān)系。

表2 線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table.2 The results of linear relation

2.4 加標(biāo)回收率

從同一來源的絞股藍(lán)樣品中取10份樣品，每份0.6g，其中9份平均分為3組，每組樣品分別加0.0096、0.064、0.16μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；剩余的1份樣品中加入與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積的水作為對(duì)照；按所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理及測定，考察16種氨基酸的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。由表3可見，在上述3個(gè)加標(biāo)水平下，16種氨基酸的回收率在75.9%～96.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.72%～8.96%之間。可見該方法具有較高的回收率和較好的精密度，可以滿足絞股藍(lán)樣品中檢測中16種氨基酸含量的需要。

2．5 13批絞股藍(lán)樣品中16種氨基酸含量的測定

應(yīng)用建立的方法，對(duì)13批平利絞股藍(lán)樣品中的游離氨基酸含量進(jìn)行了測定，各氨基酸含量見表4。由表4可以看出，13批平利絞股藍(lán)中富含多種氨基酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸4種氨基酸的含量較其他氨基酸要高，16種氨基酸的含量各不相同。

2.6 平利絞股藍(lán)氨基酸指紋圖譜的建立

將13批平利絞股藍(lán)藥材按2.1.1制備供試品溶液，按2.1.2方法進(jìn)行衍生及測定，記錄色譜圖。通過化學(xué)工作站按表1進(jìn)行積分后，將13批次測得圖譜導(dǎo)入相使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版），設(shè)定時(shí)間窗0.5，選擇保留時(shí)間為6.069的谷氨酸色譜峰和保留時(shí)間為14.79的丙氨酸色譜峰為校正峰，對(duì)13個(gè)樣品的色譜峰進(jìn)行匹配并自動(dòng)生成對(duì)照指紋圖譜，見圖4。確定指紋圖譜中有22個(gè)特征共有峰，在22個(gè)共有峰中，15號(hào)峰（丙氨酸），分離度好，因此為內(nèi)參峰。計(jì)算13批樣品峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表5，13批藥材的指紋圖譜見圖5。

2.7 13批樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

為了更好的體現(xiàn)共有特征，建立準(zhǔn)確穩(wěn)定的指

紋圖譜，分別采用相關(guān)系數(shù)，夾角余弦及中國藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版）對(duì)13批樣品HPLC圖譜進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其中相關(guān)系數(shù)，夾角余弦以13批樣品相對(duì)面積中位數(shù)為共模，相似度評(píng)價(jià)軟件13批樣品峰面積中位數(shù)為對(duì)照，以S1樣品為參照進(jìn)行相似度計(jì)算。相似度計(jì)算結(jié)果見表6。

表3 16種氨基酸的三個(gè)添加水平的加標(biāo)回收率（%）Table.3 The recovery of standard addition 16 amino acids compounds from three levels（%）

表4 13批絞股藍(lán)樣品中16種氨基酸檢測結(jié)果Table.4 The result of 16 amino acids compounds in 13 Gynostemma pentaphylla samples

圖4 平利絞股藍(lán)藥材對(duì)照指紋圖譜（共有模式）Fig.4 Representative HPLC fingerprints of pingli Gynostemma pentaphylla（common module）

圖5 平利絞股藍(lán)藥材13批次樣品指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint chromatogram for thirteen batches of samples

表5 13批平利絞股藍(lán)共有峰相對(duì)峰面積Table.5 The relative peak area of common peaks for thirteen batches of pingli Gynostemma pentaphylla

從13批次樣品HPLC指紋圖譜來看，13批絞股藍(lán)氨基酸指紋圖譜中主要有22個(gè)特征共有峰，絞股藍(lán)藥材各色譜峰經(jīng)與氨基酸對(duì)照峰比較，已確定絞股藍(lán)的指紋圖譜中22個(gè)共有峰中的1、2、7、8、9、10、11、14、15、17、18、19、20、21分別為天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸。同時(shí)發(fā)現(xiàn)13批樣品的指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致；指紋圖譜采用多種相似度指標(biāo)驗(yàn)證不同批次樣品之間的相似程度，其中相關(guān)系數(shù)、夾角余弦是特征變量上變化模式的相似性，可反應(yīng)各峰比例相似性，本實(shí)驗(yàn)13批樣品指紋圖譜均達(dá)到0.992以上；用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算的相似度均大于0.98，說明樣品指紋圖譜在構(gòu)型上極為相似，實(shí)驗(yàn)中多種指標(biāo)相似度結(jié)果具有一致性。

表6 不同相似度指標(biāo)驗(yàn)證13批平利絞股藍(lán)之間的相似程度Table.6 Differentm ethods validatesim ilarity of thirteen batches of pingli Gynostemma pentaphylla

3 結(jié)論

色譜指紋圖譜分析是對(duì)中藥及其制劑進(jìn)行綜合宏觀分析的可行手段之一。本文建立了柱前衍生高效液相色譜－熒光檢測法測定絞股藍(lán)中16種氨基酸的方法。采用所建立的方法，測定了陜西平利絞股藍(lán)的含量，同時(shí)考查了陜西平利絞股藍(lán)中氨基酸類成分指紋圖譜，結(jié)果表明由13個(gè)批次的陜西平利絞股藍(lán)藥材構(gòu)建的氨基酸指紋圖譜具有較強(qiáng)的特征性，利用夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，測得13批陜西平利絞股藍(lán)指紋圖譜相似度0.989～1.00之間，說明本方法穩(wěn)定，可靠，重復(fù)性好。

通過本次實(shí)驗(yàn)可以為初步建立陜西平利絞股藍(lán)指紋圖譜奠定基礎(chǔ)，為下一步建立完整的陜西平利絞股藍(lán)指紋圖譜體系提供方法依據(jù)。要建立陜西平利絞股藍(lán)指紋圖譜，必須要有覆蓋全、采摘加工時(shí)間和工藝一致、足夠的樣本量以及穩(wěn)定的方法體系。通過此次方法探究，可以確定采用高效液相色譜法建立陜西平利絞股藍(lán)指紋圖譜體系是可行的，但同時(shí)要有覆蓋面全且信息足夠的樣本。指紋圖譜的建立可以減少平利絞股藍(lán)品質(zhì)審評(píng)因感官審評(píng)帶來的主觀性和不確定性，可為其質(zhì)量的全面控制提供參考，并為保護(hù)平利絞股藍(lán)原產(chǎn)地域產(chǎn)品提供新的方法。

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Study on HPLC fingerprints of amino acids constituents of Gynostemma pentaphylla cultivated pingli Shaanxi

CHEN Pei-yun，GONG Dong-jun，ZHAO Zhi-lei，PANG Yan-ping
（College of Quality&Technical Supervision，Hebei University，Baoding 071002，China）

Using high performance liquid chromatography（HPLC）with Pre-column Derivation technology to study the fingerpingt chromatogram of amino acids compounds of Gynostemma pentaphylla cultivated pingli Shaanxi.Results showed that the main amino acids compounds of Gynostemma could be separated well and determined with O-phthalaldehyde as the derivatization reagent，Kromasil C18column as the chromatographic column，0.05mol/L sodium acetate with 0.5%furanidineand and methanol as the mobile phase，by the gradient elution method.13 samples of HPLC fingerprints showed that this method could identify a total of 22 chromatographic peaks as Gynostemma pentaphylla cultivated pingli Shaanxi fingerprint peaks.The similarities were determined by the coefficients of cosine，correlation and Similarity evaluation system for chromatographic fingerprint（Version 2004 A）.Results of similarity analysis were 0.989～1.00.It could generally and exactly reflect the characteristics amino acids compounds from pingli Shaanxi.The developed method provided a new method for protecting Gynostemma pentaphylla cultivated pingli source territory.

Gynostemma pentaphylla；amino acids compounds；fingerprints；Shaanxi pingli；HPLC

TS201.2

A

1002-0306（2014）06-0067-06

2013－08－05

陳培云（1973-），女，博士，主要從事食品分析檢測方面的研究。

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201210010-4）。