表面等離子體共振生物傳感器的構(gòu)建及對檸檬黃的檢測

徐坤等

摘要：建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器（FTsurface plasmon resonance，F(xiàn)TSPR）檢測食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的原理，將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結(jié)合到傳感器芯片上，通過溶液競爭法檢測檸檬黃。建立了標準曲線，獲得檢出限13 μg/L；研究了pH值對檢測的影響，得到pH 7.4為適宜的體系酸度；回收實驗、實際樣品檢測及干擾實驗的結(jié)果表明， 本方法對檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測方法相比較，F(xiàn)TSPR傳感器檢測檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：表面等離子體共振傳感器； 檸檬黃； 小鼠單克隆抗體； 飲料

1引言

食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷，不易褪色，且價格較低而應(yīng)用更廣泛。但是， 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說明迫切需要建立靈敏的檢測方法和手段。

檸檬黃是水溶性偶氮類合成色素，是被準許使用的最廣泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了諸多限制。2007年英國南安普敦大學發(fā)表了一份關(guān)于食用人工色素對兒童發(fā)育影響的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。隨后， 科學家們又對檸檬黃的危害進行進一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分別對雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃， 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關(guān)系，并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突變性[4]。針對檸檬黃過量使用的危害，已經(jīng)建立的檢測方法有紫外可見光分光光度法[5，6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學法[10]等。這些方法雖得到了很好的應(yīng)用效果，但存在著操作繁瑣、耗時長、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點。表面等離子體共振傳感器（SPR）作為一種選擇性好，靈敏度高，免標記，能夠?qū)崿F(xiàn)實時、快速、在線檢測等優(yōu)點[11]，在食品安全方面得到了廣泛的應(yīng)用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測了食物中的霉菌毒素，同時利用金納米擴大信號。本實驗采用SPR生物傳感器， 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測了實際樣品中的檸檬黃，并與紫外檢測的結(jié)果進行對比。 結(jié)果表明， SPR檢測對檸檬黃有較高的選擇性，并且檢出限（ng級）較低。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；FTSPR表面等離子體共振儀（美國Thermo公司）； RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。

檸檬黃（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巰基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亞胺鹽酸鹽（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羥基琥珀酰亞胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黃（>87%），胭脂紅（AR），蘇丹紅I（AR），以上試劑均為上海晶純試劑有限公司生產(chǎn)；小鼠檸檬黃單克隆抗體（北京瀚海生物試劑有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凱力達化工有限公司），鹽酸乙醇胺（AR，東京化成工業(yè)株式會社），磷酸鹽緩沖溶液（PBS），橙色飲料1和2購于市場。實驗用水為雙蒸水。

2.2實驗方法

2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測稱取檸檬黃0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，實驗中進一步稀釋。以PBS為參比，1 cm比色皿，在200～600 nm測定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測吸光度值，建立吸光度濃度的標準曲線。取適量橙色飲料1，在0 ℃， 12000 r/min離心30 min， 取上清液稀釋5倍備用。

2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見分光光度法檢測， 平行測定3次。根據(jù)文獻[15]， 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基，可通過中間物N羥琥珀酰亞胺（NHS）與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無色。將得到的TEBSA產(chǎn)物用紫外可見光分光光度法表征。

2.2.3SPR傳感器檢測檸檬黃 （1） 檢測方法采用溶液競爭法檢測檸檬黃：將分析物與對應(yīng)的抗體混合，并流過固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變，這樣響應(yīng)信號與分析物濃度成正比。因為抗體會帶著結(jié)合上的分析物再次結(jié)合到固定在傳感器表面的分析物上，因此響應(yīng)信號會放大。當平衡量的分析物和抗體混合時，只有未與分析物結(jié)合的抗體才會與傳感器表面的分析物結(jié)合，因此響應(yīng)信號與分析物濃度成反比關(guān)系。首先將MPA鍵合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上，利用溶液競爭法檢測檸檬黃。（2） SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液（30% H2O2濃H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水沖洗，再用氮氣吹干。將干凈的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復沖洗，再將芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水沖洗，再將芯片轉(zhuǎn)入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水沖洗后，用氮氣吹干備用。在室溫下，將芯片放入預先配置好的洗液中浸泡10 min中，將芯片表面的結(jié)合物清除，浸泡過程中需要振蕩3～5次。取出后用水沖洗，氮氣吹干備用。

2.2.4FTSPR傳感器檢測檸檬黃將處理過的芯片安裝入儀器，設(shè)定參數(shù)，PBS緩沖溶液作為流動緩沖液（所有實驗用試液經(jīng)0.45 μm孔徑膜過濾和超聲脫氣處理），流速固定為1.20 mL/min，采集背景。背景采集完畢后，固定流速為0.2 mL/min，得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過流動泵將系列處理過的檸檬黃溶液引入流動池中，與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸，自由抗體就會與芯片上的偶聯(lián)物結(jié)合，F(xiàn)TSPR實時記錄的波數(shù)變化達到穩(wěn)定時，再通入PBS至信號穩(wěn)定。

2.2.5樣品準備及檢測用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液，根據(jù)所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量（一般按抗體與檸檬黃1∶1混合），保證抗體相對于待測物是過量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體，經(jīng)孵育處理后，通入FTSPR傳感器。

分別取50 mL橙色飲料1和2， 用旋蒸器將水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，備用。稀釋至適宜倍數(shù)，進行檢測，分別平行測定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液，用橙色飲料1稀釋后，經(jīng)孵育處理，通入FTSPR傳感器檢測，平行測定3次。

3結(jié)果與討論

3.1紫外光譜檢測檸檬黃結(jié)果分析

由圖1可見，檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰，在200 nm處有半吸收峰，426 nm為主吸收峰。 通過線性擬合得線性方程為A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934?？梢宰鳛闃悠分袡幟庶S檢測的依據(jù)?；谛旁氡葹?，得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

利用標準曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L， 換算后為0.02 g/kg，低于食品添加劑使用衛(wèi)生標準（GB27602007）[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

摘要：建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器（FTsurface plasmon resonance，F(xiàn)TSPR）檢測食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的原理，將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結(jié)合到傳感器芯片上，通過溶液競爭法檢測檸檬黃。建立了標準曲線，獲得檢出限13 μg/L；研究了pH值對檢測的影響，得到pH 7.4為適宜的體系酸度；回收實驗、實際樣品檢測及干擾實驗的結(jié)果表明， 本方法對檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測方法相比較，F(xiàn)TSPR傳感器檢測檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：表面等離子體共振傳感器； 檸檬黃； 小鼠單克隆抗體； 飲料

1引言

食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷，不易褪色，且價格較低而應(yīng)用更廣泛。但是， 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說明迫切需要建立靈敏的檢測方法和手段。

檸檬黃是水溶性偶氮類合成色素，是被準許使用的最廣泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了諸多限制。2007年英國南安普敦大學發(fā)表了一份關(guān)于食用人工色素對兒童發(fā)育影響的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。隨后， 科學家們又對檸檬黃的危害進行進一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分別對雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃， 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關(guān)系，并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突變性[4]。針對檸檬黃過量使用的危害，已經(jīng)建立的檢測方法有紫外可見光分光光度法[5，6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學法[10]等。這些方法雖得到了很好的應(yīng)用效果，但存在著操作繁瑣、耗時長、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點。表面等離子體共振傳感器（SPR）作為一種選擇性好，靈敏度高，免標記，能夠?qū)崿F(xiàn)實時、快速、在線檢測等優(yōu)點[11]，在食品安全方面得到了廣泛的應(yīng)用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測了食物中的霉菌毒素，同時利用金納米擴大信號。本實驗采用SPR生物傳感器， 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測了實際樣品中的檸檬黃，并與紫外檢測的結(jié)果進行對比。 結(jié)果表明， SPR檢測對檸檬黃有較高的選擇性，并且檢出限（ng級）較低。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；FTSPR表面等離子體共振儀（美國Thermo公司）； RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。

檸檬黃（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巰基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亞胺鹽酸鹽（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羥基琥珀酰亞胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黃（>87%），胭脂紅（AR），蘇丹紅I（AR），以上試劑均為上海晶純試劑有限公司生產(chǎn)；小鼠檸檬黃單克隆抗體（北京瀚海生物試劑有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凱力達化工有限公司），鹽酸乙醇胺（AR，東京化成工業(yè)株式會社），磷酸鹽緩沖溶液（PBS），橙色飲料1和2購于市場。實驗用水為雙蒸水。

2.2實驗方法

2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測稱取檸檬黃0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，實驗中進一步稀釋。以PBS為參比，1 cm比色皿，在200～600 nm測定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測吸光度值，建立吸光度濃度的標準曲線。取適量橙色飲料1，在0 ℃， 12000 r/min離心30 min， 取上清液稀釋5倍備用。

2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見分光光度法檢測， 平行測定3次。根據(jù)文獻[15]， 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基，可通過中間物N羥琥珀酰亞胺（NHS）與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無色。將得到的TEBSA產(chǎn)物用紫外可見光分光光度法表征。

2.2.3SPR傳感器檢測檸檬黃 （1） 檢測方法采用溶液競爭法檢測檸檬黃：將分析物與對應(yīng)的抗體混合，并流過固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變，這樣響應(yīng)信號與分析物濃度成正比。因為抗體會帶著結(jié)合上的分析物再次結(jié)合到固定在傳感器表面的分析物上，因此響應(yīng)信號會放大。當平衡量的分析物和抗體混合時，只有未與分析物結(jié)合的抗體才會與傳感器表面的分析物結(jié)合，因此響應(yīng)信號與分析物濃度成反比關(guān)系。首先將MPA鍵合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上，利用溶液競爭法檢測檸檬黃。（2） SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液（30% H2O2濃H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水沖洗，再用氮氣吹干。將干凈的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復沖洗，再將芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水沖洗，再將芯片轉(zhuǎn)入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水沖洗后，用氮氣吹干備用。在室溫下，將芯片放入預先配置好的洗液中浸泡10 min中，將芯片表面的結(jié)合物清除，浸泡過程中需要振蕩3～5次。取出后用水沖洗，氮氣吹干備用。

2.2.4FTSPR傳感器檢測檸檬黃將處理過的芯片安裝入儀器，設(shè)定參數(shù)，PBS緩沖溶液作為流動緩沖液（所有實驗用試液經(jīng)0.45 μm孔徑膜過濾和超聲脫氣處理），流速固定為1.20 mL/min，采集背景。背景采集完畢后，固定流速為0.2 mL/min，得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過流動泵將系列處理過的檸檬黃溶液引入流動池中，與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸，自由抗體就會與芯片上的偶聯(lián)物結(jié)合，F(xiàn)TSPR實時記錄的波數(shù)變化達到穩(wěn)定時，再通入PBS至信號穩(wěn)定。

2.2.5樣品準備及檢測用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液，根據(jù)所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量（一般按抗體與檸檬黃1∶1混合），保證抗體相對于待測物是過量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體，經(jīng)孵育處理后，通入FTSPR傳感器。

分別取50 mL橙色飲料1和2， 用旋蒸器將水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，備用。稀釋至適宜倍數(shù)，進行檢測，分別平行測定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液，用橙色飲料1稀釋后，經(jīng)孵育處理，通入FTSPR傳感器檢測，平行測定3次。

3結(jié)果與討論

3.1紫外光譜檢測檸檬黃結(jié)果分析

由圖1可見，檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰，在200 nm處有半吸收峰，426 nm為主吸收峰。 通過線性擬合得線性方程為A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作為樣品中檸檬黃檢測的依據(jù)?；谛旁氡葹?，得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

利用標準曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L， 換算后為0.02 g/kg，低于食品添加劑使用衛(wèi)生標準（GB27602007）[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

摘要：建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器（FTsurface plasmon resonance，F(xiàn)TSPR）檢測食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結(jié)合的原理，將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結(jié)合到傳感器芯片上，通過溶液競爭法檢測檸檬黃。建立了標準曲線，獲得檢出限13 μg/L；研究了pH值對檢測的影響，得到pH 7.4為適宜的體系酸度；回收實驗、實際樣品檢測及干擾實驗的結(jié)果表明， 本方法對檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測方法相比較，F(xiàn)TSPR傳感器檢測檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：表面等離子體共振傳感器； 檸檬黃； 小鼠單克隆抗體； 飲料

1引言

食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷，不易褪色，且價格較低而應(yīng)用更廣泛。但是， 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結(jié)構(gòu)的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說明迫切需要建立靈敏的檢測方法和手段。

檸檬黃是水溶性偶氮類合成色素，是被準許使用的最廣泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了諸多限制。2007年英國南安普敦大學發(fā)表了一份關(guān)于食用人工色素對兒童發(fā)育影響的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內(nèi)的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。隨后， 科學家們又對檸檬黃的危害進行進一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分別對雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃， 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關(guān)系，并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突變性[4]。針對檸檬黃過量使用的危害，已經(jīng)建立的檢測方法有紫外可見光分光光度法[5，6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學法[10]等。這些方法雖得到了很好的應(yīng)用效果，但存在著操作繁瑣、耗時長、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點。表面等離子體共振傳感器（SPR）作為一種選擇性好，靈敏度高，免標記，能夠?qū)崿F(xiàn)實時、快速、在線檢測等優(yōu)點[11]，在食品安全方面得到了廣泛的應(yīng)用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測了食物中的霉菌毒素，同時利用金納米擴大信號。本實驗采用SPR生物傳感器， 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測了實際樣品中的檸檬黃，并與紫外檢測的結(jié)果進行對比。 結(jié)果表明， SPR檢測對檸檬黃有較高的選擇性，并且檢出限（ng級）較低。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；FTSPR表面等離子體共振儀（美國Thermo公司）； RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。

檸檬黃（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巰基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亞胺鹽酸鹽（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羥基琥珀酰亞胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黃（>87%），胭脂紅（AR），蘇丹紅I（AR），以上試劑均為上海晶純試劑有限公司生產(chǎn)；小鼠檸檬黃單克隆抗體（北京瀚海生物試劑有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凱力達化工有限公司），鹽酸乙醇胺（AR，東京化成工業(yè)株式會社），磷酸鹽緩沖溶液（PBS），橙色飲料1和2購于市場。實驗用水為雙蒸水。

2.2實驗方法

2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測稱取檸檬黃0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，實驗中進一步稀釋。以PBS為參比，1 cm比色皿，在200～600 nm測定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測吸光度值，建立吸光度濃度的標準曲線。取適量橙色飲料1，在0 ℃， 12000 r/min離心30 min， 取上清液稀釋5倍備用。

2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見分光光度法檢測， 平行測定3次。根據(jù)文獻[15]， 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基，可通過中間物N羥琥珀酰亞胺（NHS）與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無色。將得到的TEBSA產(chǎn)物用紫外可見光分光光度法表征。

2.2.3SPR傳感器檢測檸檬黃 （1） 檢測方法采用溶液競爭法檢測檸檬黃：將分析物與對應(yīng)的抗體混合，并流過固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變，這樣響應(yīng)信號與分析物濃度成正比。因為抗體會帶著結(jié)合上的分析物再次結(jié)合到固定在傳感器表面的分析物上，因此響應(yīng)信號會放大。當平衡量的分析物和抗體混合時，只有未與分析物結(jié)合的抗體才會與傳感器表面的分析物結(jié)合，因此響應(yīng)信號與分析物濃度成反比關(guān)系。首先將MPA鍵合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上，利用溶液競爭法檢測檸檬黃。（2） SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液（30% H2O2濃H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水沖洗，再用氮氣吹干。將干凈的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復沖洗，再將芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水沖洗，再將芯片轉(zhuǎn)入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水沖洗后，用氮氣吹干備用。在室溫下，將芯片放入預先配置好的洗液中浸泡10 min中，將芯片表面的結(jié)合物清除，浸泡過程中需要振蕩3～5次。取出后用水沖洗，氮氣吹干備用。

2.2.4FTSPR傳感器檢測檸檬黃將處理過的芯片安裝入儀器，設(shè)定參數(shù)，PBS緩沖溶液作為流動緩沖液（所有實驗用試液經(jīng)0.45 μm孔徑膜過濾和超聲脫氣處理），流速固定為1.20 mL/min，采集背景。背景采集完畢后，固定流速為0.2 mL/min，得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過流動泵將系列處理過的檸檬黃溶液引入流動池中，與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸，自由抗體就會與芯片上的偶聯(lián)物結(jié)合，F(xiàn)TSPR實時記錄的波數(shù)變化達到穩(wěn)定時，再通入PBS至信號穩(wěn)定。

2.2.5樣品準備及檢測用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液，根據(jù)所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量（一般按抗體與檸檬黃1∶1混合），保證抗體相對于待測物是過量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體，經(jīng)孵育處理后，通入FTSPR傳感器。

分別取50 mL橙色飲料1和2， 用旋蒸器將水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，備用。稀釋至適宜倍數(shù)，進行檢測，分別平行測定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液，用橙色飲料1稀釋后，經(jīng)孵育處理，通入FTSPR傳感器檢測，平行測定3次。

3結(jié)果與討論

3.1紫外光譜檢測檸檬黃結(jié)果分析

由圖1可見，檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰，在200 nm處有半吸收峰，426 nm為主吸收峰。 通過線性擬合得線性方程為A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934?？梢宰鳛闃悠分袡幟庶S檢測的依據(jù)?；谛旁氡葹?，得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

利用標準曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L， 換算后為0.02 g/kg，低于食品添加劑使用衛(wèi)生標準（GB27602007）[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。