液相—子空間夾角判據(jù)聯(lián)用分析飲料中的檸檬黃和日落黃

宋光均等

摘要：通過(guò)液相-光譜聯(lián)用，采用向量-子空間夾角判據(jù)進(jìn)行計(jì)算，建立了飲料中檸檬黃和日落黃的分析方法。該方法先采用全波長(zhǎng)光纖光譜儀建立不同濃度檸檬黃和日落黃的標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以及市售碳酸型飲料和功能型飲料的樣品光譜數(shù)據(jù)，再進(jìn)行液相-光譜聯(lián)用，得到扣除飲料中待測(cè)組分后的本底光譜數(shù)據(jù)；運(yùn)用向量-子空間夾角判據(jù)進(jìn)行計(jì)算飲料中檸檬黃和日落黃的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，在3～30 μg/mL內(nèi)檸檬黃和日落黃的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好（R2檸檬黃=0.997 6，R2日落黃=0.999 8）；向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算結(jié)果與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果比較，相對(duì)誤差小于2.5%，樣本加標(biāo)回收率為89.5%～109.0%，RSD為4.9%～6.1%，該方法能滿(mǎn)足定量分析需求。

關(guān)鍵詞：向量-子空間夾角；多波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)光譜；高效液相色譜；檸檬黃；日落黃

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4277-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.044

檸檬黃和日落黃是碳酸型飲料和功能型飲料中廣泛添加的人工合成色素，由于添加過(guò)量色素會(huì)對(duì)健康造成不良影響，因此建立碳酸型飲料和功能型飲料中檸檬黃和日落黃的分析方法對(duì)食品安全檢測(cè)具有重要的作用。

目前檸檬黃和日落黃的分析方法有高效液相色譜法[1]、紫外分光光度法[2]、多元線(xiàn)性回歸分光光度法[3]、熒光光譜法[4]、薄層色譜掃描法[5]、示差脈沖極譜法[6]等。檸檬黃含量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB4481.1-2010）[7]和日落黃含量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB6227.1-2010）[8]都已頒布，各個(gè)行業(yè)可根據(jù)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，也可在這些技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。隨著儀器技術(shù)和信息技術(shù)的飛躍發(fā)展，分析化學(xué)已不再是依賴(lài)物質(zhì)消耗手段來(lái)獲取信息，而是逐步發(fā)展成為化學(xué)信息科學(xué)。姚志湘課題組提出了采用“向量-子空間夾角”判據(jù)逐步扣減混合光譜中的待測(cè)組分光譜，判斷出待測(cè)組分恰好消失的“等當(dāng)點(diǎn)”并計(jì)算混合體系中待測(cè)組分含量的方法。該方法已經(jīng)運(yùn)用于化妝品中對(duì)羥基苯甲酸酯、醬油中苯甲酸鈉和山梨酸鉀的測(cè)定[9，10]。本研究基于穩(wěn)健的“向量-子空間夾角”判據(jù)，采用液相-光譜聯(lián)用技術(shù)，建立了飲料中檸檬黃和日落黃的同時(shí)分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Maya2000紫外-可見(jiàn)光纖光譜儀（美國(guó)海洋光學(xué)，掃描波長(zhǎng)范圍為190～1 100 nm）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）。檸檬黃（1934-21-0，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；日落黃（2783-94-0，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；乙腈（分析純，安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；乙酸銨（分析純，西隴化工）；飲料（市售）。

1.2 分析方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 分別精確稱(chēng)取0.149 5 g檸檬黃、0.150 3 g日落黃對(duì)照品于燒杯中，用二次蒸餾水溶解，分別轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，得到1 495 μg/mL檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和1 503 μg/mL日落黃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)多波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)光譜儀的響應(yīng)范圍，用二次蒸餾水依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)母液，得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別測(cè)定一系列不同濃度的檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液的190～1 100 nm紫外可見(jiàn)光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)最小二乘回歸得到多波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)（v）。

1.2.2 建立市售飲料樣本光譜數(shù)據(jù) 取一定量的碳酸型飲料，超聲20 min，然后用0.22 μm濾膜過(guò)濾。測(cè)定各飲料樣品的190～1 100 nm紫外可見(jiàn)光譜（a）。

1.2.3 建立飲料本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù) 確定被測(cè)組分與本底組分完全分離的高效液相色譜條件，將液相與光譜聯(lián)用，采集市售飲料樣本經(jīng)過(guò)色譜柱完全分離后的190～1 100 nm光譜數(shù)據(jù)，分別扣除功能型飲料和碳酸型飲料樣品中與檸檬黃、日落黃具有相同出峰時(shí)間的光譜數(shù)據(jù)后，得到本底光譜數(shù)據(jù)（N）。

1.2.4 高效液相色譜條件 色譜柱為Agilent C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫為30 ℃；可見(jiàn)紫外光纖光譜儀掃描波長(zhǎng)為190～780 nm。流動(dòng)相梯度∶0.01～9.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸銨水溶液=10∶90（V/V）；9.01～20.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸銨水溶液=40∶60（V/V）；20.01～35.00 min，乙腈∶水=10∶90（V/V）；35.01～60.00 min，乙腈∶水=95∶5（V/V）。

1.2.5 “向量-子空間夾角判據(jù)”數(shù)據(jù)處理方法 將上述標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)v，本底光譜數(shù)據(jù)N、以及樣品光譜數(shù)據(jù)a導(dǎo)入計(jì)算平臺(tái)，應(yīng)用向量-子空間夾角判據(jù)算法算出飲料樣本中待測(cè)組分的實(shí)際含量。具體步驟為：①依據(jù)定量精度設(shè)定扣減步長(zhǎng)Δ；②在函數(shù)yi=aix+bi中帶入較大的x1值，得到v1；其中，yi為在i波長(zhǎng)下待測(cè)組分的吸光度值，ai、bi是常數(shù)，x表示檸檬黃或日落黃的濃度，v1表示在濃度為x1時(shí)待測(cè)組分的多波長(zhǎng)吸光度值y1，v1為所有的yi值組成的矩陣；③從所述飲料樣本的光譜數(shù)據(jù)a中扣除v1/Δ，扣除后的變量為da；把本底光譜數(shù)據(jù)N和變量da合并后記為對(duì)比空間M，計(jì)算對(duì)比空間M與v1夾角；④從待測(cè)飲料樣本光譜數(shù)據(jù)a中逐步扣除v1后，重復(fù)步驟“3”；⑤當(dāng)所述飲料樣本中的待測(cè)組分完全被扣除后比對(duì)空間M和待測(cè)組分的光譜向量v1空間夾角值會(huì)出現(xiàn)最大值θmax，記錄空間夾角最大值θmax出現(xiàn)時(shí)對(duì)應(yīng)的扣減步數(shù)λ，通過(guò)待測(cè)組分的濃度x1和扣減步數(shù)λ，計(jì)算飲料樣本中待測(cè)組分的含量Y1，用函數(shù)關(guān)系定義為：Y1=x1×λ/Δ；⑥比較Y1值與x1值的差值，該差值大于誤差允許范圍，則帶入一個(gè)與Y1值相接近的x2進(jìn)入步驟“2”中重新計(jì)算。

1.2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 在已知濃度的兩份飲料樣品中分別添加一定量的檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)品，采用“向量-子空間夾角判據(jù)”方法測(cè)定加標(biāo)回收率。

1.2.7 精密度試驗(yàn) 分別準(zhǔn)備兩種飲料樣品各5份，采集樣本190～1 100 nm的光譜數(shù)據(jù)，采用“向量-子空間夾角判據(jù)”方法計(jì)算樣品中檸檬黃和日落黃含量，計(jì)算精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立標(biāo)準(zhǔn)光譜庫(kù)

分別配制系列濃度（3～30 μg/mL）的檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水為空白對(duì)照，分別采集系列溶液的190～1 100 nm光譜，記入標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)。在檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)中取450 nm處的各個(gè)濃度吸光度進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得到檸檬黃在450 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.026 4x+0.026 5，R2=0.999 8；在日落黃標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)中取480 nm處的各個(gè)濃度吸光度進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得到日落黃在480 nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=0.041 3x+0.052 4，R2=0.999 8。

2.2 建立市售飲料樣本光譜庫(kù)

在全波長(zhǎng)下測(cè)定各飲料樣品的光譜，構(gòu)成飲料樣本光譜a。

2.3 建立飲料本底光譜庫(kù)

在待測(cè)組分與本底組分完全分離的高效液相色譜條件下，得到待測(cè)樣本和對(duì)照品樣本的高效液相色譜圖。圖1為待測(cè)組分對(duì)照品在450 nm處的高效液相色譜圖，其中A為檸檬黃、B為日落黃，兩種色素的出峰時(shí)間分別為檸檬黃4.678 min、日落黃16.299 min；圖2和圖3為飲料樣本在450 nm處的高效液相色譜圖，經(jīng)分析對(duì)比，樣品色譜圖中A為檸檬黃、B為日落黃，其他的色譜峰為飲料樣本中相對(duì)于色素的本底物質(zhì)。采用液相-光譜聯(lián)用采集多波長(zhǎng)色譜數(shù)據(jù)，以檸檬黃的測(cè)定結(jié)果為例，從功能型飲料的多波長(zhǎng)色譜圖中扣除與檸檬黃具有相同保留時(shí)間的多波長(zhǎng)色譜數(shù)據(jù)，其余數(shù)據(jù)為檸檬黃的本底光譜數(shù)據(jù)；從碳酸型飲料的多波長(zhǎng)色譜圖中扣除與檸檬黃具有相同保留時(shí)間的多波長(zhǎng)色譜數(shù)據(jù)，其余數(shù)據(jù)為檸檬黃的本底光譜數(shù)據(jù)。

功能型飲料和碳酸型飲料的本底光譜數(shù)據(jù)N1和N2數(shù)據(jù)量巨大，直接采用N1和N2作為本底數(shù)據(jù)，計(jì)算時(shí)間長(zhǎng)，運(yùn)算較困難，影響了方法的時(shí)效性。以檸檬黃為例，選用主成分分析[11]，在標(biāo)準(zhǔn)化的飲料樣本光譜中添加一定強(qiáng)度的白噪聲蔽不均勻噪聲和非線(xiàn)性因素的干擾，以二階差分值序列的折點(diǎn)判斷獨(dú)立變量數(shù)目，得到體系主成分?jǐn)?shù)目q。

其中功能型飲料扣除檸檬黃的本底主成分?jǐn)?shù)為22，碳酸飲料扣除檸檬黃后的本底主成分?jǐn)?shù)為21。應(yīng)用[U，S，V]=svd（N）分別對(duì)兩種飲料本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)N1和N2進(jìn)行奇異值分解降維，經(jīng)分解后分別得到m階行正交矩陣U、n階列正交矩陣V和奇異值矩陣S，功能飲料本底取U得前22列為降維后的本底數(shù)據(jù)，碳酸飲料本底取U的前21列，分別重新記作N1、N2。同理，飲料中日落黃含量的分析按檸檬黃的數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的降維。

2.4 市售飲料中檸檬黃、日落黃的測(cè)定

將上述的樣品光譜數(shù)據(jù)、本底光譜數(shù)據(jù)、檸檬黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)濃度值，以及不同濃度標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入計(jì)算平臺(tái)，應(yīng)用向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算飲料中檸檬黃和日落黃的含量。本研究的方法與高效液相色譜法進(jìn)行比較，如表1所示。

由表1可知，采用向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算飲料中檸檬黃和日落黃的含量，與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果作對(duì)比，得到的RSD都小于2.5%，說(shuō)明向量-子空間夾角判據(jù)測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

2.5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，在已知濃度的碳酸飲料中分別添加等體積的檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，在另一份已知濃度的功能飲料中添加等體積的檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后采用向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示。兩種待測(cè)組分的樣品加標(biāo)回收率為89.5%～109.0%，RSD為4.9%～6.1%。表明該方法準(zhǔn)確可信，可用于市售飲料的快速檢測(cè)。

2.6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

采用“向量-子空間夾角判據(jù)”計(jì)算各樣品中檸檬黃和日落黃含量，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知，精密度小于0.35%，說(shuō)明方法的精密度良好。

3 小結(jié)與討論

本研究通過(guò)采用液相-紫外可見(jiàn)光譜聯(lián)用，分別建立不含被測(cè)組分的本底光譜數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)和待測(cè)樣品的一維混合光譜，再通過(guò)“向量-子空間夾角”判據(jù)進(jìn)行計(jì)算，可解決成分復(fù)雜的混合體系中自配本底組分建庫(kù)不全的缺點(diǎn)，該方法對(duì)于同種樣品的測(cè)定，進(jìn)行一次液相分離后，無(wú)需再利用液相-光譜聯(lián)用積累本底，僅通過(guò)采集樣品的一維光譜，即可實(shí)現(xiàn)同類(lèi)飲料中檸檬黃和日落黃的測(cè)定，可降低儀器使用和減小試劑消耗，方法準(zhǔn)確性和精密度較好，方法滿(mǎn)足定量分析要求。

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