廣東魴幼魚對銅、鎘脅迫的氧化應激響應及其指示意義

曾艷藝，賴子尼，楊婉玲，高原，王超，劉乾甫，張威振，趙李娜

廣東魴幼魚對銅、鎘脅迫的氧化應激響應及其指示意義

曾艷藝，賴子尼*，楊婉玲，高原，王超，劉乾甫，張威振，趙李娜

中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，珠江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，珠江水域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與評價功能實驗室，農(nóng)業(yè)部珠江中下游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，廣東 廣州，510380

廣東魴（Megalobrama terminalis）是具重要經(jīng)濟價值的珠江流域特有魚類，已列入國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護品種。近年來，隨著河流固有生境持續(xù)破壞，重金屬等水體污染問題不斷加劇，以廣東魴為代表的當?shù)靥赜恤~類資源急劇下降。文章以銅、鎘暴露對廣東魴幼魚48 h的半致死濃度值LC50暴露濃度強度為1個毒性單位（TU）為基準，以室內(nèi)靜水實驗法研究了銅、鎘離子在低效應濃度、中效應濃度、高效應濃度（分別對應于0.01 TU、0.03 TU和0.11 TU）脅迫對廣東魴幼魚的氧化應激效應，以期找出適宜的生物標記物，完善珠江水域污染評價與預警體系。結(jié)果顯示，廣東魴幼魚MDA、GSH、T-AOC、SOD和CAT（以Pr計）隨暴露濃度及暴露時間發(fā)生變化，其范圍分別在1.08～7.34 nmol·mg-1、0.42～22.82 mg·g-1、0.10～1.32 U·mg-1、2.45～13.24 U·mg-1和0.01～0.09 U·mg-1之間。其中，GSH、MDA和T-AOC在銅、鎘暴露后第1天迅速響應至高值，相應的各濃度處理組明顯高于對照組。曲線回歸結(jié)果顯示，GSH與暴露濃度c（以TU量計）之間呈顯著的二次曲線關(guān)系，擬合方程為GSH=-2112(c-0.084)2+18.1，r=0.847，n=10，P=0.012，暴露濃度閾值為0.084 TU。SOD和CAT則在暴露后第4天響應至高值。曲線回歸結(jié)果顯示，SOD與c及CAT與c之間均呈顯著的二次曲線關(guān)系，擬合方程分別為SOD=-2073(c-0.059)2+14.3，r=0.840，n=10，P=0.014；CAT=-21.2(c-0.056)2+0.102，r=0.877，n=10，P=0.006，相應的暴露濃度閾值分別為0.059 TU和0.056 TU。與暴露濃度呈顯著的二次曲線關(guān)系的各指標中，GSH響應最為迅速，SOD和CAT的響應最為靈敏，加之SOD與CAT相關(guān)性極強，表明GSH、SOD和CAT這3種氧化應激指標可作為珠江流域水體污染的潛在生物標記物。

廣東魴；重金屬；氧化應激；毒性單位；生物標記物

1 材料與方法

1.1實驗材料

廣東魴生活在水體中下層，喜棲息于江河底質(zhì)多淤泥或石礫的緩流處；以水生植物及軟體動物為食。自然種群的成魚在每年的3─4月間產(chǎn)卵，仔、幼魚以浮游生物為食，人工養(yǎng)殖幼魚可以人工飼料等為食。本次實驗廣東魴幼魚購自廣州市吉鯧水產(chǎn)魚苗繁殖基地，以曝氣2 d以上的自來水在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)以供實驗。魚苗平均體長2.5±0.2 cm，體重0.35±0.07 g。在室內(nèi)自然光照下暫養(yǎng)，水體pH7.6～7.8，水溫26～28 ℃，硬度126～138 mg(CaCO3)·L-1，溶解氧7.20～7.85 mg·L-1。暫養(yǎng)條件下魚苗自然死亡率＜2%，實驗前1 d停止喂食。

1.2試劑藥品

藥品CuSO4·5H2O、CdCl2·2.5H2O和NaCl2均為分析純。先分別以去離子水配制濃度為1 g·L-1（均為離子質(zhì)量濃度，下同）的銅、鎘貯備液濃度，實驗時以預先經(jīng)過曝氣48 h的自來水配成所需的實驗濃度。

1.3毒性單位確定及實驗設置

以48 h致半數(shù)廣東魴死亡的暴露濃度(48 h LC50)為1個毒性單位，金屬暴露濃度以計量單位TU表示。根據(jù)等毒性法設置低、中、高3個濃度效應組的銅、鎘單一亞急性毒性及聯(lián)合毒性脅迫廣東魴幼魚實驗，其中聯(lián)合毒性以1∶1毒性單位配比法設置。預先對該批廣東魴幼魚進行單一銅、鎘48 h急性毒性實驗，得出銅的48 h LC50及其95%置信區(qū)間為0.8（0.6～1.0）mg·L-1，鎘的48 h LC50及其95%置信區(qū)間為1.4（1.2～1.7）mg·L-1。依據(jù)漁業(yè)水質(zhì)標準（GB11607-89）中相應濃度限值（銅為0.01 mg·L-1；鎘為0.005 mg·L-1），該標準是基于多種水生標準測試生物毒性結(jié)果制定的安全濃度值，理論上其毒性單位為1% LC50，可認為這兩個濃度值對廣東魴的毒性單位數(shù)相等，為0.01 TU，故由此確定低銅、鎘濃度組；中、高暴露濃度組則根據(jù)銅、鎘單獨暴露對廣東魴48 h LC50的1/30和1/9設置，銅、鎘的聯(lián)合脅迫組以銅、鎘各貢獻一半毒性單位數(shù)的配比方式分別設置低、中、高效應濃度值，故低、中、高暴露濃度分別為0.01 TU、0.03 TU和0.11 TU，各組濃度的配制如表1所示。

表1 廣東魴幼魚暴露濃度（TU）設置及實驗始末銅、鎘質(zhì)量濃度Table 1 The nominal toxic concentrations (TU) and the determined concentrations of Cu and Cd at the initial and the end of toxic experiment on juvenile M. terminalis mg·L-1

1.4實驗過程

由于魚樣品氧化應激指標的測定可能受檢測過程中的處理溫度和指標分析時限影響較大，因此在實驗中分預實驗和正式實驗進行。預實驗的目的是為了確定樣品的組內(nèi)個體差異值范圍，分別在玻璃缸中僅以所設的3個中濃度組，實驗組2、5和8（見表1）配制體積為20 L的水體，每個濃度的缸

里放入30尾實驗魚，靜置實驗。分別在實驗第1、4和7天從每個缸里取5尾魚，每尾魚分別進行蛋白質(zhì)（protein，Pr）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量等氧化應激指標分析。結(jié)果確定了每組樣品所測指標的個體之間的差異＜10%（n=5）。

正式實驗時，在水體體積為10 L的玻璃養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。每個實驗組放入10尾廣東魴幼魚，靜置實驗。實驗期間不投餌、不充氣，自然光照，水體理化指標保持與暫養(yǎng)條件相同。正式實驗開始后，分別在第1、4、7和14天分別從各處理組中取出2尾魚，用超純水沖洗后吸干，將樣品存放于-20 ℃超低溫冰箱，并在2 h內(nèi)勻漿，勻漿樣品4 ℃保存以待各氧化應激指標分析，其中，CAT、GSH和T-AOC在4 h內(nèi)分析完畢，SOD和MDA在6 h內(nèi)分析完畢。此外，在實驗初始及實驗結(jié)束時分別從各處理組取上層水樣，以石墨爐原子吸收分光光度法測定其中銅、鎘濃度。根據(jù)漁業(yè)水質(zhì)標準（GB11607-89）規(guī)定的方法利用Agilent AA DUO原子吸收光譜儀測定。

1.5樣品的處理

全魚樣品去鰭后（每尾質(zhì)量約0.3 g）放入小燒杯，以質(zhì)量體積比約為1∶9的比例先加入0.86%冰冷生理鹽水2/3，用潔凈小剪迅速將魚體剪碎成小組織塊，將剪碎的組織與生理鹽水混合液倒入玻璃勻漿器，再加入余下的1/3生理鹽水潤洗小燒杯將組織液全量轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器，在冰上研磨5～8 min使組織勻漿化，制成10%左右的勻漿液。將制好的勻漿轉(zhuǎn)移至潔凈離心管，在4 ℃、3000 r·min-1離心10 min，棄沉淀留上清液保存在4 ℃，以待進行以下各氧化應激指標測定。

1.6氧化應激指標的測定

Pr含量、T-AOC、SOD、CAT活性及GSH和MDA含量是利用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒，結(jié)合紫外可見分光光度計測定。其中，Pr測定采用考馬斯亮藍法，用小牛血清蛋白做標準曲線；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，每毫克蛋白在1 ml反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量，為1個SOD活力單位；采用H2O2分解法測CAT，每毫克蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的H2O2相對量，為一個CAT活力單位；T-AOC采用Fe3+還原法測定，37 ℃時，每分鐘每毫克組織蛋白使反應體系的吸光度值每增加0.01時為一個T-AOC單位；采用二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH含量，以Pr計，單位為mg·g-1；采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定丙二醛（MDA）含量，以Pr計，其單位為nmol·mg-1。各指標的測定步驟參照南京建成生物公司的試劑盒說明書。

1.7數(shù)據(jù)分析

采用K-S檢驗確定各變量利用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較不同暴露時間各響應指標之間的均值差異；經(jīng)K-S檢驗確定各變量服從正態(tài)分布后，利用Excell軟件對銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應激效應進行毒性單位與效應關(guān)系分析并作圖；利用成對樣本t檢驗法分析低、中和高濃度銅、鎘單一因子和聯(lián)合處理組對廣東魴幼魚的氧化應激效應差異；采用相關(guān)分析判別廣東魴幼魚各響應指標之間的相關(guān)性。除特別注明外，統(tǒng)計分析均在SPSS16.0 for Windows下進行。

2 結(jié)果

實驗期間廣東魴幼魚無死亡。實驗初始和實驗結(jié)束時各實驗組中銅、鎘濃度如表1所示，期間銅、鎘濃度測定值與實驗設定值誤差（＜20%），在允許范圍內(nèi)。

2.1銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應激指標隨暴露時間的變化

廣東魴幼魚各氧化應激指標隨實驗暴露時間的變化如表2所示。正式實驗期間所有處理組MDA含量（以Pr計，下同）在1.08～7.34 nmol·mg-1之間。暴露第1天后即達高值，顯著高于第4、7、14天（df=3，F(xiàn)=38.60，P＜0.001），且各處理組明顯高于對照組；其后，隨暴露時間的延長而下降，并保持相對恒定，且各處理組并未明顯高于對照組。意味著廣東魴受亞急性銅、鎘濃度暴露后，很快表現(xiàn)出氧化損傷，但隨著機體啟動抗氧化防御系統(tǒng)后，氧化損傷程度有所下降。

GSH含量（以Pr計，下同）變化較大，在0.42～22.82 mg·g-1之間。其中暴露第1天后迅速至高值，顯著高于第4、7、14天（df=3，F(xiàn)=31.99，P＜0.001），各處理組亦明顯高于對照組，其后均隨暴露時間的延長而下降，并保持相對恒定，且各處理組并未明顯高于對照組。這意味著廣東魴受亞急性銅、鎘濃度暴露后，隨著體內(nèi)氧化壓力的產(chǎn)生，機體首先啟動以GSH為代表的第一道抗氧化防御防線來清除氧自由基，GSH含量迅速增加，但隨著暴露時間的延長，對GSH消耗增加，GSH含量很快降低。

T-AOC是機體總抗氧化壓力的指標，T-AOC活力（以Pr計，下同）在0.10～1.32 U·mg-1之間變化，亦是暴露第1天達高值，顯著高于第4、7、14

天（df=3，F(xiàn)=22.02，P＜0.001），且各處理組明顯高于對照組，隨后第4、7天逐漸下降，而在第14天又有所回升，但除第1天外，其余時間顯示各處理組并未明顯高于對照組。

SOD活性（以Pr計，下同）在2.45～13.24 U·mg-1之間變動，隨著暴露時間的延長，SOD活性在第4天顯著高于其余時間（df=3，F(xiàn)=67.64，P＜0.001），且僅在第4天銅、鎘不同濃度暴露脅迫組與對照組的SOD水平差異較大，其它時間差異不明顯。

CAT活性（以Pr計，下同）變化范圍為0.01～0.09 U·mg-1，其與SOD活性變化趨勢相似，亦在第4天顯著高于其他時間（df=3，F(xiàn)=24.81，P＜0.001）。CAT活性亦是在第4天時不同銅、鎘濃度處理組明顯高于對照組，而在其他時間處理組與對照組的差異不明顯。

表2 廣東魴幼魚各氧化應激指標隨實驗暴露時間的變化響應統(tǒng)計描述Table 2 Statistic description of time-variation of response substances in juvenile M. terminalis to Cu2+, Cd2+exposure

2.2銅、鎘脅迫對廣東魴氧化應激響應的劑量—效應關(guān)系

實驗第1天時GSH、T-AOC和MDA達高值，且各處理組與對照組之間存在明顯的差異，故對銅、鎘脅迫下第1天的GSH、T-AOC和MDA響應值與暴露濃度（以TU計）進行劑量—效應關(guān)系分析，曲線回歸分析結(jié)果如圖1所示。曲線關(guān)系式表示為y=A(c-B)2+C，其中y為各氧化應激響應指標，A為系數(shù)，c為暴露濃度（以TU計），B為相應氧化應激響應指標達到最大時對應的暴露濃度，C為相應氧化應激指標的最大值（下同）。廣東魴幼魚GSH與暴露濃度之間呈顯著（P＜0.05）的二次曲線關(guān)系（P=0.012），且在暴露濃度為0.084 TU時GSH含量最高，對應于銅、鎘單一因子暴露的濃度分別為0.067、0.118 mg·L-1，對應的聯(lián)合暴露濃度為0.034 mg·L-1銅與0.059 mg·L-1鎘。盡管T-AOC和MDA與暴露濃度呈一定的二次曲線關(guān)系，但在統(tǒng)計學上不顯著（P＞0.05）。

圖1 銅、鎘暴露濃度與廣東魴幼魚GSH、T-AOC、MDA水平的劑量—效應關(guān)系Fig. 1 The concentration-effect relationships between GSH , T-AOC, MDA levels in juvenile M. terminalis and Cu2+, Cd2+exposure concentrations

實驗第4天時SOD和CAT達到最大，且各處理組與對照組之間存在明顯的差異，從而對銅、鎘脅迫下第4天的SOD、CAT活性與銅、鎘暴露濃度（以TU計）進行劑量—效應回歸分析，結(jié)果如圖2所示。廣東魴幼魚SOD和CAT活性與暴露濃度呈顯著（P＜0.05）的二次曲線關(guān)系，P值分別為0.014和0.006；SOD在暴露濃度為0.059 TU時達到最大，對應的銅、鎘單一因子暴露濃度分別為0.047和0.082 mg·L-1，對應的聯(lián)合暴露濃度為0.024 mg·L-1

銅與0.041 mg·L-1鎘。CAT在暴露濃度為0.056 TU時達到最大，對應的銅、鎘單一因子暴露濃度分別為0.045和0.078 mg·L-1，對應的聯(lián)合暴露濃度為0.022 mg·L-1銅與0.039 mg·L-1鎘。

圖2 銅、鎘暴露濃度與廣東魴幼魚CAT、SOD活性的劑量—響應關(guān)系Fig. 2 The concentration-effect relationships between CAT, SOD activities in juvenile M. terminalis and Cu2+, Cd2+exposure concentrations

2.3銅和鎘脅迫對廣東魴幼魚氧化應激響應的聯(lián)合效應

進行成對樣本t檢驗前，分別求銅、鎘單一因子低、中和高濃度毒性脅迫下的SOD、CAT活性、T-AOC及GSH和MDA均值（如低濃度組的SODa計算公式為：SODa=1/2(SOD1+SOD4)，其中1和4為實驗組號，見表1），連同對應的銅和鎘聯(lián)合處理組低、中、高濃度組各指標（如低濃度組SODd=SOD7）進行各單獨變量K-S檢驗，各變量均服從正態(tài)分布（n=12，P＞0.05）。進而對相應的單一銅、鎘低、中、高濃度暴露組各指標均值與聯(lián)合處理組各指標實測值進行成對樣本t檢驗，結(jié)果如表3所示。盡管各變量在單一毒性均值與聯(lián)合毒性實測值雖有差異，但檢驗的P值均大于0.05。意味著銅、鎘聯(lián)合脅迫與銅、鎘單獨作用效應差異無顯著的統(tǒng)計學意義，即銅、鎘對廣東魴幼魚的氧化毒性及抗氧化防御響應可能是協(xié)同或弱協(xié)同作用，拮抗和增強作用均不顯著。

表3 銅、鎘單一因子和聯(lián)合毒性脅迫下廣東魴幼魚氧化應激響應指標成對樣本t檢驗結(jié)果Table 3 The results of paired-sample T test on oxidative stress and responses of juvenile M.terminalis to single and combined exposure of Cu2+and Cd2+

2.4銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應激響應指標之間的關(guān)系

由于各指標值不完全服從正態(tài)分布，其兩兩間采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果如表4所示：廣東魴幼魚SOD與CAT活性呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，但SOD與其它3個指標無顯著的相關(guān)性；MDA含量與T-AOC、GSH含量亦呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，同時T-AOC與GSH含量亦呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系；但CAT活性與MDA和GSH含量存在顯著的負相關(guān)關(guān)系，而其它指標兩兩之間的線性關(guān)系不顯著。

表4 銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚氧化應激指標兩兩間的Spearman相關(guān)系數(shù)Table 4 Spearman correlation coefficients of MDA, GSH, SOD, CAT and T-AOC of juvenile M. terminalis to Cu2+, Cd2+exposure

3 討論

重金屬脅迫下，魚類往往會產(chǎn)生不同程度的氧化應激響應，這時機體活性氧自由基增多，超出自身清除能力，導致機體氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，表現(xiàn)在其維生素C、維生素E、GSH等非酶抗氧化產(chǎn)物，SOD、CAT等抗氧化酶等被誘導或消耗（Martinez-Alvarez等，2005）。此時，機體往往伴隨著不同程度的脂質(zhì)過氧化損傷，MDA是機體內(nèi)ROS攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化物，MDA的量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出機體氧化損傷的程度（Guel等，2004）。

現(xiàn)階段的研究表明，魚類氧化應激響應在魚的不同種類中呈現(xiàn)特定的時間變化趨勢（Srikanth等，

2013）。一般情況下，魚體率先利用維生素C、維生素E、GSH等小分子非酶抗氧化產(chǎn)物清除過多的ROS，構(gòu)成魚類抗氧化防御的第一道防線，當這些非酶抗氧化產(chǎn)物不足以清除過多的ROS時，魚體則啟動合成抗氧化酶以減少超負荷的氧化壓力，達動態(tài)平衡（Martinez-Alvarez等，2005）。本研究中廣東魴幼魚暴露于亞急性銅、鎘后第1天，其GSH含量快速增加，MDA水平也快速增加，表明在亞急性銅、鎘脅迫下廣東魴幼魚較快產(chǎn)生氧化壓力，而機體也快速啟動第一道防線；此外，廣東魴幼魚的總抗氧化能力T-AOC也在第1天快速增加亦可作為廣東魴幼魚機體快速啟動抗氧化防御的佐證。隨著暴露時間的延長，GSH的消耗量增大，因此廣東魴幼魚體內(nèi)的GSH水平迅速降低，相反SOD、CAT酶等活性增強（在第4天最強），此后的14 d內(nèi)，廣東魴的氧化壓力與抗氧化防御響應達到較穩(wěn)定的動態(tài)平衡狀態(tài)，氧化損傷與各抗氧化應激指標均有所下降（如表2所示）。而Pandey等（2008）對翠鱧（Channa punctate）的研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬暴露30 d之間，翠鱧的SOD和GSH含量呈下降趨勢，CAT也在暴露7 d后開始下降。另外，砷對翠鱧的90 d脅迫研究顯示了GSH的波動變化特征，暴露前7 d，GSH含量增加，而到第60天則下降，到第90天時又有所恢復(Allen和Rana，2004)。然而，短期（96 h）急性銅暴露（5.5 mg·L-1Cu）致使長須魚丹（Esomus danricus）抗氧化防御機制受損，表現(xiàn)在SOD和CAT在暴露期間持續(xù)下降，MDA水平持續(xù)增加（Vutukuru等，2006）?？梢?，魚類種類、暴露金屬種類、暴露方式等差異均可致使魚體內(nèi)氧化應激響應的差異。因此，在利用魚類的氧化應激響應指標作為重金屬污染的生物標記物前，應盡可能均一化毒物濃度，掌握該生物標記物的動態(tài)變化規(guī)律，排除其他影響因素的干擾。

氧化應激指標作為污染生物標記物的另一重要前提條件是：其誘導需與污染暴露劑量存在特定的劑量—響應關(guān)系。本研究中，在亞急性銅、鎘暴露下廣東魴幼魚最敏感時期的氧化應激響應與暴露濃度之間符合二次曲線關(guān)系，這與以往報道鎘暴露下鰱組織中SOD中的拋物線關(guān)系一致（呂景才等，2002），而二次曲線頂點所對應的暴露濃度值可被認為是魚體對重金屬污染從適應到中毒反應的閾值，低于該閾值時的金屬暴露是魚體適應性反應，而高于閾值時的抑制作用可能是中毒反應的前兆。盡管廣東魴各氧化應激指標最高時對應的中毒反應閾值有些微差異，但各氧化應激響應指標中，又屬SOD和CAT活性最為靈敏，這兩者分別在暴露濃度為0.056 TU和0.059 TU時達最高值，小于該暴露濃度閾值的銅、鎘重金屬暴露均會隨著暴露濃度的增加，SOD和CAT響應值增加，而我國現(xiàn)有的漁業(yè)水質(zhì)標準（GB11607-89）對銅、鎘規(guī)定的暴露濃度之和為0.02 TU，位于本研究的響應指標中毒閾值以內(nèi)，理論上SOD和CAT水平可作為污染程度的指示。而GSH則響應最為迅速，暴露第1天后即迅速響應。因此，對于重金屬銅、鎘暴露而言，廣東魴幼魚機體GSH屬于快速響應生物標記物，而SOD和CAT屬于靈敏響應標記物。

廣東魴幼魚在銅、鎘脅迫下的氧化應激響應之間存在密切的關(guān)系（如表3所示）。其中，SOD與CAT活性之間相關(guān)性最強，相關(guān)系數(shù)高達0.87（n=40），這極可能與氧化壓力下SOD和CAT的催化作用機制有關(guān)。當抗氧化底物缺乏時，魚體內(nèi)SOD結(jié)合CAT共同構(gòu)成了機體應對氧化壓力的另一道防線，通常情況下CAT活性的增強或減弱會和SOD保持一致，因為這兩種酶互相協(xié)作，同步反應（Asagba等，2008）。其中，SOD的抗氧化防御是將超氧陰離子自由基（O2˙-）歧化為O2和H2O2，CAT則進一步催化H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2，從而在一定程度上阻止氧化損傷的發(fā)生，維持機體氧化與抗氧化防御動態(tài)平衡（Roméo等，2000）。這在對其他種類如叉尾鮰（Wallago attu）（Pandey等，2003），尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）（Asagba等，2008）、奧尼羅非（Oreochromis niloticus）（Atli等，2006）的研究中亦得到驗證。然而，另一些研究則發(fā)現(xiàn)CAT的誘導或是抑制與SOD并不同步（Sampain等，2008），這可能與機體應對氧化壓力產(chǎn)生的CAT巰基易被金屬結(jié)合后失活的速度和效率差異有關(guān)（Kono和Fridovich，1982）。此外，T-AOC與GSH含量的相關(guān)系數(shù)亦高達0.84，這意味著對廣東魴而言，GSH在其總抗氧化活力當中發(fā)揮重要的作用，因此GSH含量的變化決定著其T-AOC變化趨勢。T-AOC是機體總的抗氧化能力的指標，包括GSH及GSH以外的酶促和非酶促抗氧化體系產(chǎn)物的總抗氧化能力。GSH是由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽，是組織中主要的非蛋白的巰基化合物。它可以清除細胞內(nèi)的O2˙-、H2O2、LOOH等自由基（Srikanth等，2013）。GSH含量迅速升高是廣東魴應對重金屬產(chǎn)生ROS的脅迫的一種快速自我保護機制。廣東魴幼魚在亞急性銅、鎘脅迫下應激指標的正、負相關(guān)性則反映出機體應對氧化脅迫的相互依賴或代償作用的動態(tài)變化。

本研究中銅、鎘聯(lián)合暴露對廣東魴幼魚的脅迫作用效果表明了他們之間潛在協(xié)同作用的方式，而Roméo等（2000）的研究則表明銅、鎘脅迫下歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）的抗氧化壓力響應不同。

今后可通過廣東魴幼魚組織、器官的響應研究進一步驗證并闡明銅、鎘對廣東魴幼魚的聯(lián)合作用方式及其作用機制。

4 結(jié)論

本文探討了珠江流域特有魚類廣東魴幼魚在應對水體亞急性銅、鎘脅迫時的機體氧化應激響應。GSH對銅、鎘暴露則在第1天后即迅速響應至高值，SOD與CAT則在暴露第4天顯示高值。GSH、SOD和CAT被誘導至高值期間與重金屬銅、鎘暴露濃度呈顯著的二次曲線關(guān)系。其中，SOD與CAT則在暴露濃度為0.05～0.06 TU時即靈敏響應，且SOD與CAT之間具強相關(guān)性，可作為水體污染的潛在生物標記物。

但廣東魴幼魚的氧化應激響應隨脅迫時間的動態(tài)變化較大，故在將其應用于自然環(huán)境中重金屬污染的指示前仍需開展進一步研究，尤其在各種重金屬聯(lián)合毒性作用方式，及以毒性單位均一化法確定毒物暴露濃度與響應指標之間的劑量—效應關(guān)系及其影響因素方面的研究需要進一步深入。

致謝：

衷心感謝中科院南海海洋研究所張黎研究員對本文英文摘要的潤色。

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Responses towards Oxidative Stress of Juvenile Guangdong Bream Megalobrama terminalis to Cu2+and Cd2+Exposure

ZENG Yanyi, LAI Zini*, YANG Wanling, GAO Yuan, WANG Chao, LIU Qianfu, ZHANG Weizhen, ZHAO Lina
Fishery Eco-environment Monitoring and Evaluation Function Laboratory of the Pearl River Valley, Experimental Station for Scientific Observation on Fishery Resources and Environment in the Middle and Lower Reaches of Pearl River, Pearl River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China

Guangdong bream (Megalobrama terminalis) is an endemic fish species with great economic value in the Pearl River watershed. It has been listed in the National Aquatic Germ-plasma Resources Conservation Project in China. However, as the natural habitats of the fishes is continuously destroyed, and heavy metals and other water pollution problems are aggravated, many endemic fish resources represented by Guangdong bream is sharply declined in recent years. In this study, a series static bioassay were carried out on Guangdong bream juvenile in order to find the appropriate biomarkers to improve the evaluation and early warning system for pollution in the Pearl River watershed. The fish were exposed to the separated or combined Cu2+and Cd2+at low, medium, and high toxic concentrations responding to 0.01 TU, 0.03 TU and 0.11 TU, respectively(1 TU, toxic unit is the 48 h LC50of Cu2+or Cd2+in Guangdong bream juvenile) for 14 days. The substances and enzymes towards to oxidative stress including malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and total antioxidant capacity (T-AOC) were determined on day 1, 4, 7, and 14 during the exposure period. The results show that MDA, GSH concentrations and T-AOC, SOD and CAT activities (all of the five substances were calculated by protein content, similarly hereinafter) in the juvenile bream were within the range of 1.08～7.34 nmol·mg-1, 0.42～22.82 mg·g-1, 0.10～1.32 U·mg-1, 2.45～13.24 U·mg-1and 0.01～0.09 U·mg-1, respectively, and varied according to exposure time and exposure concentrations.. The concentrations of GSH, MDA and the T-AOC activity in the fish were significantly increased after Cu2+and Cd2+exposure, and rapidly reached the peak on day 1. The relationship between GSH level and the exposure concentration (c, in the unit of TU) of Cu2+and Cd2+were well fitted with the conic curves GSH=-2112(c-0.084)2+18.1, r=0.847, n=10, P=0.012 on day 1, and the toxic concentration threshold was calculated as 0.084 TU. The other two substances SOD and CAT activities were also significantly elevated after Cu2+and Cd2+exposure and reached the peak on day 4. The relationships between SOD, CAT activities and the exposure toxic units of Cu2+and Cd2+were also well fitted with the conic curves SOD=-2073(c-0.059)2+14.3, r=0.840, n=10, P=0.014; CAT=-21.2(c-0.056)2+0.102, r=0.877, n=10, P=0.006, respectively on day 4, and the thresholds concentrations were 0.059 TU to SOD and 0.056 TU to CAT. In summary, GSH was the most rapid response substance to the exposure, while SOD and CAT activities were more sensitive to the exposure and more correlated to each other. This study suggests that GSH, SOD and CAT in the juvenile M. terminalis could be developed as potential biomarkers for water pollution in the Pearl River watershed.

Megalobrama terminalis; heavy metal; oxidative stress and response; toxic unit; biomarker

X171.5

A

1674-5906（2014）12-1972-08

廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項（201101I02）；2015年農(nóng)業(yè)部部門預算（物種資源保護）項目（C977）

曾艷藝（1983年生），女，助理研究員，博士，研究方向為水域重金屬污染生態(tài)與毒理。E-mail: yanyizeng84@163.com

*通訊作者：E-mail: znlai01@163.com

2014-09-12

曾艷藝，賴子尼，楊婉玲，高原，王超，劉乾甫，張威振，趙李娜. 廣東魴幼魚對銅、鎘脅迫的氧化應激響應及其指示意義[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2014, 23(12): 1972-1979.

ZENG Yanyi, LAI Zini, YANG Wanling, GAO Yuan, WANG Chao, LIU Qianfu, ZHANG Weizhen, ZHAO Lina. Responses towards Oxidative Stress of Juvenile Guangdong Bream Megalobrama terminalis to Cu2+and Cd2+Exposure [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(12): 1972-1979.

河流重金屬污染及其對水域生態(tài)系統(tǒng)的危害日益嚴重，已引起全球范圍的普遍關(guān)注（Sikder等，2013）。魚類作為河流生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在受重金屬污染時，其氧化應激響應指標比形態(tài)可見癥狀的反應要靈敏、迅速，可作為污染指示。在受重金屬脅迫的氧化壓力下，魚類為保護自身免受氧毒性損傷啟動一套抗氧化防御系統(tǒng)，以維持體內(nèi)活性氧代謝的平衡。魚類的抗氧化防御系統(tǒng)包括小分子非酶抗氧化劑如谷胱甘肽、維生素C、維生素E，及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等抗氧化物酶（Martinez-Alvarez等，2005）。以往的大量研究結(jié)果表明，重金屬脅迫下，魚類的抗氧化防御響應在不同魚及其發(fā)育生長階段的差異性顯著（Giari等，2007；Asagba等，2008；Atli和Canli，2010；Liu等，2011；Liu等，2011；曹亮，2010）。廣東魴（Megalobrama terminalis），隸屬鯉形目、鯉科、鲌亞科、魴屬，是具重要經(jīng)濟價值的珠江流域特有魚類（中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所等，1990）。但自80年代以來，以廣東魴為代表的當?shù)靥赜恤~類資源急劇下降（陸奎賢，1990），除航道建設、采砂、水壩等工程項目破壞魚類固有的棲息地及阻斷洄游通道外，水環(huán)境污染可能也是重要的原因（李捷等，2010）。作者所在的珠江流域漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心長期跟蹤監(jiān)測珠江中下游水環(huán)境狀況發(fā)現(xiàn)，銅和鎘是該水域主要重金屬污染物，這主要與珠江上游

重金屬相關(guān)工、礦業(yè)迅猛發(fā)展過程中廢液、廢渣等排放有關(guān)。這些重金屬污染物大部分沉積于江底，隨江水、洪水沖刷向下游遷移，并在河口富集，而河口又是珠江魚類早期生長育肥的場所，長此以往，必然對當?shù)佤~類，尤其是對重金屬敏感的仔稚幼魚，產(chǎn)生毒性效應。此外，謝文平等對珠三角魚類養(yǎng)殖池塘水和底泥的調(diào)查中亦發(fā)現(xiàn)銅、鎘污染的情況較為嚴重（謝文平等，2014）。然而，國內(nèi)外有關(guān)環(huán)境污染因子對廣東魴的生態(tài)毒理研究資料缺乏，僅有少量報道（許淑英等，1998；李琳等，2013；曾艷藝等，2014；Zeng等，2014）。為此，作者在延續(xù)銅和鎘對珠江天然仔魚和幼魚的急性毒性效應研究的基礎(chǔ)上，以該流域特有種類廣東魴幼魚為實驗對象，進一步開展了銅、鎘亞急性脅迫對其氧化應激效應的研究，以期找出適宜的生物標記物，完善珠江流域污染評價與預警體系，從而為珠江魚類資源的保護提供科學依據(jù)。