車(chē)前草多糖微波提取工藝研究

郭 婕，胡春紅，袁淑培，劉中華，李季平

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466000）

車(chē)前草多糖微波提取工藝研究

郭 婕，胡春紅，袁淑培，劉中華，李季平

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466000）

為探討車(chē)前草多糖提取率的影響因素，本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助提取法，以車(chē)前草多糖提取率為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)料液比、微波功率、微波處理時(shí)間、浸提溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，影響車(chē)前草多糖提取率的因素順序?yàn)椋何⒉ㄌ幚頃r(shí)間＞料液比＞浸提溫度＞微波功率。車(chē)前草多糖的最佳提取工藝為料液比1∶25（g/mL）、微波功率為450W、微波處理時(shí)間4min、浸取溫度為70℃。在此條件下，車(chē)前草多糖的提取率為9.41%±0.23%。該法提取的車(chē)前草多糖提取率高，且節(jié)省時(shí)間。

車(chē)前草，多糖，微波提取

車(chē)前草為車(chē)前科植物，其性味甘寒，具有利水通淋、止瀉、清肝明目、清肺化痰等功效[1]，不僅可藥用，還可食用。隨著現(xiàn)代中藥化學(xué)的不斷發(fā)展，從車(chē)前草中分離出許多有效成分，例如多糖、黃酮及其苷類(lèi)等[2]。植物多糖是中草藥的重要活性成分，并具有多種生物活性和保健功能[3-4]，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)界、餐飲界等領(lǐng)域中。研究表明，多糖有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、抗凝血等功效，且毒副作用較小[5]。但是由于分離純化方面的困難，要得到高純度的活性多糖并不容易[6]。研究證實(shí)，相對(duì)于酶法和超聲波法，微波的熱效應(yīng)能使細(xì)胞壁破裂，同時(shí)使細(xì)胞膜中的酶失去活性，細(xì)胞中的多糖很容易突破細(xì)胞壁和細(xì)胞膜障礙而被提取出來(lái)[7]。因此，微波輔助法提取多糖，可以縮短實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)時(shí)間，同時(shí)還可以提高提取率及產(chǎn)品純度[8]，并且節(jié)省溶劑[9]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)車(chē)前草的報(bào)道主要集中于熊果酸、總黃酮[10]及車(chē)前草的種子（車(chē)前子多糖的藥理學(xué)）[11]等方面的研究。對(duì)車(chē)前草多糖的研究不是很深入，特別是對(duì)車(chē)前草多糖的提取方法報(bào)道較少，且所見(jiàn)報(bào)道中主要采用的是傳統(tǒng)的熱水浸提法，而微波輔助法提取車(chē)前草多糖尚未見(jiàn)有研究報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助法提取車(chē)前草多糖，在料液比、微波功率、微波處理時(shí)間、浸提溫度四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定車(chē)前草多糖的最佳提取工藝條件，旨在為車(chē)前草多糖的提取提供參考，也為進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

車(chē)前草 購(gòu)于周口市同和堂大藥店，產(chǎn)地河南周口；葡萄糖 天津市津化化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純；正丁醇 開(kāi)封化學(xué)試劑總廠(chǎng)，分析純；無(wú)水乙醇 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)，分析純；苯酚 天津市永大化學(xué)

試劑開(kāi)發(fā)中心，分析純（重蒸后使用）；乙醚 天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純；硫酸 洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司，分析純；三氯甲烷 分析純；實(shí)驗(yàn)用水 為蒸餾水。

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；實(shí)驗(yàn)室微波爐 南京杰全微波設(shè)備有限公司；SHB-III循環(huán)水式真空泵 鄭州歐卡儀器設(shè)備有限公司；HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；UV-5100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[12]稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.25g，于1000m L容量瓶中定容至刻度。分別準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80m L，置于試管中，各加蒸餾水補(bǔ)足至每管1m L，再各加入6%的苯酚溶液1m L，搖勻，依次加入98%的濃硫酸5m L，搖勻，靜止15m in后，置于40℃的水浴鍋中30m in，冷卻后在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖含量（μg/m L）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。其線(xiàn)性回歸方程為y= 0.0073x-0.0188，R2=0.9993。

1.2.2 車(chē)前草多糖提取工藝流程[13]干燥的車(chē)前草，粉碎，過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取10g→蒸餾水浸泡1h，微波提取兩次→抽濾→合并提取液→在合并的提取液中，加入氯仿∶正丁醇（5∶1）混合液后充分搖勻→4000r/min離心10min，取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20mL左右→按照濃縮液與乙醇比為1∶3的比例加入無(wú)水乙醇沉淀多糖→攪拌均勻、靜置12h過(guò)夜→4000r/min離心15min，取沉淀→用乙醚洗滌沉淀，4000r/min離心10min→干燥箱內(nèi)40℃烘干→蒸餾水溶解定容至50mL。

1.2.3 車(chē)前草多糖提取率的測(cè)定 從稀釋的樣品提取液中各取出1m L，置于10m L的試管中，依照上述方法處理，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度。按照以下公式[14]計(jì)算車(chē)前草粗多糖的提取率（%）。

車(chē)前草粗多糖提取率（%）=C0VK×10-4/W×100

式中：C0-測(cè)量液多糖的濃度（μg/m L）；V-粗提取液體積（m L）；K-稀釋倍數(shù)；W-原料干重（g）。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 料液比的選擇 稱(chēng)取車(chē)前草5份，各10g，于500m L錐形瓶中。以蒸餾水為提取劑，分別設(shè)置料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/m L），置于70℃水浴鍋中加熱1h后，450W微波處理3m in，提取兩次，研究料液比對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響。

1.2.4.2 微波功率的選擇 稱(chēng)取車(chē)前草5份，各10g，于500m L錐形瓶中。以蒸餾水為提取劑，料液比為1∶25，置于70℃水浴鍋中加熱1h后，微波處理3min，提取兩次，研究不同微波功率150、300、450、600、750W對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響。

1.2.4.3 微波處理時(shí)間的選擇 稱(chēng)取車(chē)前草5份，各10g，于500m L錐形瓶中。以蒸餾水為提取劑，料液比為1∶25，置于70℃水浴鍋中加熱1h后，微波功率為300W，研究微波處理時(shí)間1、2、3、4、5m in對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響。

1.2.4.4 浸提溫度的選擇 稱(chēng)取車(chē)前草5份，各10g，于500m L錐形瓶中。以蒸餾水為提取劑，料液比為1∶25，微波功率為300W的條件下，分別設(shè)置水浴鍋溫度50、60、70、80、90℃，研究浸提溫度對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 為了確定料液比、微波功率、微波處理時(shí)間、浸提溫度四個(gè)因素共同作用對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表對(duì)以上四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。因素水平安排見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響 由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，車(chē)前草多糖提取率隨著溶液量的增加而增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g/m L）時(shí)多糖提取率達(dá)到最大，為8.74%。當(dāng)溶液量繼續(xù)增加至1∶30時(shí)，多糖提取率反而下降。其原因可能是隨著料液比的增加，浸提液也相應(yīng)增加，濃縮時(shí)間長(zhǎng)，在高溫下多糖斷裂而損失，使得提取率下降[15]。且溶液量太大會(huì)影響后續(xù)的濃縮等操作，綜合考慮，料液比1∶25為佳。

圖1 料液比對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響Fig.1 Influence ofsolid-liquid ratio on polysaccharide extraction

2.1.2 微波功率對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響 由圖2可知，隨著微波功率的增大，車(chē)前草多糖提取率先上升后有所下降。當(dāng)微波功率為300W時(shí)，車(chē)前草多糖提取率達(dá)到最大為8.81%。其主要原因是微波功率過(guò)高產(chǎn)熱會(huì)造成溶劑的揮發(fā)甚至暴沸，增加溶劑的損失，多糖的結(jié)構(gòu)也可能被破壞[16]，造成車(chē)前草多糖提取率有下降的趨勢(shì)。因此，選擇微波功率為300W。

圖2 微波功率對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響Fig.2 Influence ofmicrowave poweron polysaccharide extraction

2.1.3 微波處理時(shí)間對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響 由圖3可知，微波處理時(shí)間少于2m in時(shí)，多糖提取率無(wú)明顯升高，此后多糖的提取率顯著升高。隨著微波處理時(shí)間的增加，車(chē)前草細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞程度增大，因此多糖提取率提高[17]；在4m in以后，多糖提取率又有所下降。微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖在微波過(guò)程中分解，純度降低。因此綜合考慮，微波處理時(shí)間為4min時(shí)最佳。

圖3 微波處理時(shí)間對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響Fig.3 Influence ofmicrowave-heating time on polysaccharide extraction

2.1.4 浸提溫度對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響 結(jié)果圖4顯示，浸提溫度為70℃時(shí)多糖提取率最高，為9.01%，隨后溫度繼續(xù)升高而多糖提取率有下降趨勢(shì)。主要原因是，在一定范圍內(nèi)溫度升高能夠增加植物細(xì)胞膜的通透性，便于多糖浸出；但溫度過(guò)高也會(huì)使較多的雜質(zhì)溶出，不僅增加分離難度[18]，而且溫度太高會(huì)破壞多糖的生物活性，色澤加深，黏度加大[19]。因此，選擇浸提溫度為70℃。

圖4 浸提溫度對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響Fig.4 Influence of temperature on polysaccharide extraction

2.2 微波輔助法提取車(chē)前草多糖的正交優(yōu)化結(jié)果

以車(chē)前草多糖提取率為指標(biāo)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析，影響車(chē)前草多糖提取率的幾個(gè)因素順序?yàn)椋何⒉ㄌ幚頃r(shí)間＞料液比＞浸提溫度＞微波功率。最佳組合為A2B3C2D2，即車(chē)前草多糖的最佳提取工藝為料液比1∶25（g/m L）、微波功率為450W、微波處理時(shí)間4min、浸取溫度為70℃。按照最佳提取工藝條件組合，重復(fù)三次，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，所得車(chē)前草多糖的提取率分別為9.32%、9.67%、9.24%。故最佳提取工藝條件下，車(chē)前草多糖提取率為9.41%±0.23%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用有效成分提取的一項(xiàng)新技術(shù)——微波輔助法提取車(chē)前草中的多糖，以車(chē)前草多糖提取率為指標(biāo)，研究了料液比、微波功率、微波處理時(shí)間、浸提溫度四個(gè)因素共同作用對(duì)車(chē)前草多糖提取率的影響，并利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了車(chē)前草多糖的最佳提取工藝條件。經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到的車(chē)前草多糖最佳提取條件為：料液比1∶25（g/m L）、微波功率為450W、微波處理時(shí)間4m in、浸取溫度為70℃，其中微波處理時(shí)間對(duì)車(chē)前草多糖的提取率影響最大。在此最優(yōu)提取條件下，車(chē)前草多糖的提取率為9.41%±0.23%。微波輔助提取法在提高車(chē)前草多糖提取率、節(jié)省時(shí)間等方面體現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。旨在為車(chē)前草多糖的提取方法提供參考，同時(shí)為進(jìn)一步充分利用車(chē)前草這種資源提供很好的理論依據(jù)。

[1]廖春燕，楊遠(yuǎn)萍．大孔吸附樹(shù)脂法去除車(chē)前草粗多糖中的蛋白質(zhì)[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（6）：193-195，200．

[2]張強(qiáng)，張相年．車(chē)前草超氧化物歧化酶的分離純化及種類(lèi)鑒定[J]．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24（1）：76-78，91．

[3]李官浩，楊詠潔，南昌希．車(chē)前草多糖的提取及純化工藝研究[J]．食品科技，2008（10）：156-159．

[4]陳旋，張翼，張劍波．植物多糖的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)新藥雜志，2007，16（13）：1000-1005．

[5]張曉靜，劉會(huì)東．植物多糖提取分離及藥理作用的研究進(jìn)展[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14（8）：495-497．

[6]Li Zhongrui，Wang Bin，Zhang Qihong，et al.Microwaveassisted extraction and the antioxidant activity of water-soluble polysaccharide from Palmaria palmate[R].InternationalConference on Bioinformatics and Biomedical Engineering，2011.

[7]張萍，梁新麗，廖正根，等．正交設(shè)計(jì)優(yōu)選黃芪多糖的微波輔助與傳統(tǒng)提取工藝研究[J]．江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，21（1）：33-35．

[8]Yang Yifang，F(xiàn)eng Jingqian，Xu Haiyan，et al.Influence of different extraction and purification methods on astragalus polysaccharides and pharmacological evaluation[J].Chinese Herbal Medicines，2010，2（1）：54-61.

[9]Xiao Xiaohua，Song Wei，Wang Jiayue，et al.Microwaveassisted extraction performed in low temperature and in vacuo for the extraction of labile compounds in food samples[J].Analytica Chimica Acta，2012，712：85-93.

[10]肖懷秋，李玉珍．車(chē)前草粗多糖提取及生物學(xué)活性研究[J]．食品與發(fā)酵科技，2009，45（3）：37-40．

[11]孫玉軍，陳彥，王瑞君，等．車(chē)前草多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)初探[J]．熱帶作物學(xué)報(bào)，2012，33（10）：1882-1885．

[12]陳鈞輝，李俊，張?zhí)?，等．生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]．科學(xué)出版社，2008，15．

[13]張佳蘭，張水鷗．微波輔助浸提黃芪多糖的工藝研究[J]．陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：39-41，57．

[14]石奇，石異，楊曉慧，等．微波法提取大棗多糖的工藝研究[J]．應(yīng)用科技，2008，35（7）：55-57．

[15]魏亞冉，閆曉輝．楊樹(shù)菇多糖提取工藝的研究[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2006（5）：55-56，59．

[16]田成，程超．鴨跖草水溶性多糖的微波輔助提取[J]．食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28（8）：98-100．

[17]王敏，趙倩．微波輔助提取雙糖飲中多糖的工藝研究[J]．中國(guó)藥房，2007，18（36）：2828-2829．

[18]何傳波，湯鳳霞，熊何?。⒉ㄝo助提取鐵觀音茶多糖及其抗氧化活性研究[J]．集美大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，14（3）：251-255．

[19]王文平，郭祀遠(yuǎn)，李琳，等．野木瓜中多糖提取工藝研究[J]．食品科技，2007（1）：99-101．

Study on the extraction of polysaccharide from Plantago asiatica L.using microwave-assisted extraction

GUO Jie，HU Chun-hong，YUAN Shu-pei，LIU Zhong-hua，LI Ji-ping
（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466000，China）

To explore the influence factors impacting extraction rate of polysaccharide from Plantago asiatica L.，the optimal extraction conditions using microwave -assisted extraction were optimized by single factor andorthogonal experiment，which included the solid -liquid ratio，microwave power，microwave -heating time andextraction temperature from the point of extraction rate of polysaccharide. The results showed that the effect ofthe factors impacting extraction rate of polysaccharide was in the order as microwave -heating time ＞solidliquidratio＞extraction temperature＞microwave power. The optimal conditions were as follows：the 1∶25（g/mL）ratio of solid -liquid，microwave power was 450W，extracting at 70℃ for 4min. The maximum amounts ofpolysaccharide 9.41%±0.23% were obtained under these conditions. The method had higher rate on theextraction of polysaccharide from Plantago asiatica L. and could save the time.

Plantago asiatica L.；polysaccharide；microwave-assisted extraction

TS201.1

：B

：1002-0306（2014）16-0223-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.041

2013－11－19

郭婕（1984-），女，碩士研究生，講師，研究方向：天然藥物化學(xué)。

周口師范學(xué)院2014年實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目（K201443）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A416110）。