核桃花粉提取物的抗氧化性研究

王 丹，翟梅枝，毛光瑞，史冠昭

（西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西楊凌712100）

核桃花粉提取物的抗氧化性研究

王 丹，翟梅枝*，毛光瑞，史冠昭

（西北農(nóng)林科技大學林學院，陜西楊凌712100）

以甲醇、乙醇、水為溶劑提取西林2、西林3、西扶2、西洛3和香玲等5個核桃品種花粉的活性成分，通過測定不同溶劑提取物的總酚含量、還原能力、DPPH自由基清除能力和抗脂質(zhì)氧化能力評價核桃花粉的抗氧化活性。結果表明：核桃花粉提取物的還原能力與提取物中的總酚含量呈正相關，順序為：甲醇提取物＞乙醇提取物＞水提取物；對DPPH自由基的清除作用大小為：乙醇提取物＞甲醇提取物＞水提取物；5種花粉的水提取物抗脂質(zhì)氧化能力較強；西林2的還原能力和清除DPPH自由基的能力最強；西林3水提物的抗脂質(zhì)氧化活性最好。

核桃花粉，提取物，抗氧化性

核桃（Juglans regia Linn）屬胡桃科（Juglandaceae）核桃屬（Juglans）植物，在我國分布廣泛，種植面積達三千一百七十五萬畝，總產(chǎn)量居世界第一[1]。一株20年生的核桃盛果期大樹，能產(chǎn)2～4kg的雄花，110～220g花粉[2-3]，但作為授粉所需量甚微，大部分散落。我國核桃雄花產(chǎn)量很大，但對花粉相關研究甚少。Bonvehf，Silva，Leja，Almaraz-Abarca等分別對幾種植物花粉進行了提取分離，在花粉中分離出黃酮物質(zhì)并研究其抗氧化性[4-7]?；ǚ壑胸S富的抗氧化物，可以提高免疫力，延緩衰老，治療和預防心血管病等退變性疾病，此外，還有抗炎癥、抗敏感等作用[8-11]。由俞秀玲等[12]對核桃花粉的營養(yǎng)成分分析可知，核桃花粉蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)成分優(yōu)于其他花粉，又由于其較強的抗氧化性，因此核桃花粉是一種高級的功能食品和化妝品原料。本研究是以五種不同品種的核桃花粉為研究對象，對不同的提取溶劑下花粉提取物的抗氧化性進行對比研究，以期能夠尋找出相關規(guī)律，為高品質(zhì)核桃花粉原料的挑選提供指導，以及對核桃花粉的進一步研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃花粉 2012年4月底采自西北農(nóng)林科技大學山陽核桃實驗站，經(jīng)分撿、除雜，自然風干后裝袋備用；原兒茶酸、1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）、三氯化鐵、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、碳酸鈉、卵磷脂、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）等 均為分析純。

AUY120型電子天平 日本島津公司；UV-1200型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；KH-500D型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 稱取5種核桃花粉（西林2、西扶2、香玲、西洛3、西林3）各5g，分別用水、80%乙醇、70%甲醇料液比1∶25加熱回流1h，離心分離，取出上清液。殘渣溶解再提取1h，合并兩次提取液，濃縮，冷凍

干燥得不同溶劑的核桃花粉浸膏提取物，測浸膏提取率。稱取不同花粉浸膏提取物0.02g，用蒸餾水超聲溶解并定容至10m L，配制成2mg/m L的花粉提取液，置于-4℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 總酚含量測定 對核桃花粉樣品中的總多酚采用改進的Folin-Ciocalteu比色法[13]。

1.2.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取5mg原兒茶酸，并用蒸餾水溶解定容至50m L，配制成0.1mg/m L的對照品溶液。取7支10m L具塞刻度試管，分別移取0.0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8m L原兒茶酸對照品溶液于試管中，加入1m L Folin-Ciocalteu顯色劑，然后各試管中加入5m L 1mol/L的碳酸鈉水溶液，用蒸餾水定容至10m L，混合均勻后，在室溫下避光放置1h，于760nm處測定其吸光值。以原兒茶酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標做標準曲線，得到回歸方程為y=11.55x+ 0.001（R2=0.998），說明此方程在原兒茶酸濃度0～0.08mg/m L間線性良好，可用此方程作為測定樣品總酚含量的標準方程。

1.2.2.2 樣品的測定 準確移取核桃花粉提取液0.4m L，按相同的方法測吸光值。并根據(jù)標準曲線方程計算樣品提取物中總酚含量，其表示為每克浸膏提取物中相當于原兒茶酸的毫克數(shù)。

1.2.3 還原能力的測定 移取核桃花粉提取液0.5m L，依次加入2m L磷酸鹽緩沖溶液（PBS 0.2mol/L，pH7.4），和5m L 1%的鐵氰化鉀，置于50℃水浴中反應20m in，然后加5m L 10%三氯乙酸，混勻。吸取上清液2.5m L，加入2.5m L純凈水，0.5m L 0.1%三氯化鐵，反應5m in后在700nm處測吸光值，以吸光度值表示其還原能力，同時以1mg/m L VC溶液做對照樣品。每組樣品進行3次重復實驗。

1.2.4 DPPH自由基清除實驗 準確稱取1mg DPPH自由基，置于25m L容量瓶中，配成0.04mg/m L DPPH乙醇溶液，分別吸取核桃花粉提取液0.8m L，然后加入DPPH乙醇溶液5m L，室溫下避光放置1h，于517nm處測吸光值，同時以1mg/m L VC溶液做對照樣品。每組樣品進行3次重復實驗。

“本地方言里，郭與穀的發(fā)音是一樣的。穀這個字難寫，現(xiàn)在也沒幾個人認得了，再說過去的城也沒有了，以前那么多的東西，都沒有了?！?/p>

1.2.5 TBA抗脂質(zhì)氧化實驗 準確吸取1m L卵磷脂溶液（100mg卵磷脂溶解于10m L乙醇中，后用pH 7.4的PBS溶液定溶到100m L），加入不同花粉提取液1m L，2.5mmol·L-1EDTA-Fe（Ⅱ）1m L，混合均勻后于37℃水浴1h，再加入3m L混合顯色液（0.2%TBA溶液與20%TCA溶液按1∶1混合），混勻后于與100℃沸水中加熱10m in，冷卻后加入1m L三氯甲烷充分混合吸收油滴，靜止澄清后，取上清液于532nm下測定其吸光值A樣，用PBS溶液代替樣品做空白測吸光度A0，每組樣品進行3次重復實驗。按下式計算抗脂質(zhì)氧化抑制率：

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取對核桃花粉提取率的影響

表1 五種核桃花粉的提取率（%）Table 1 The extraction rate of 5 kinds ofwalnut staminate pollen（%）

由表1可知，水、乙醇（80%，V/V）和甲醇（70%，V/V）3種不同溶劑的5種核桃花粉浸膏提取率均小于45%。不同溶劑的同種花粉提取率大小順序均為：乙醇＞甲醇＞水。其中，乙醇和甲醇兩種溶劑的提取率差別不大，水的提取率相對較低，這是因為花粉提取物中多為極性小的有機物質(zhì)，根據(jù)相似相容原理，易溶于極性相似的醇溶液中。

2.2 不同溶劑提取對核桃花粉總酚含量的影響

圖1 五種核桃花粉不同溶劑提取物的總酚含量Fig.1 Total phenolic content of 5 kinds ofwalnut staminate pollen extracts

通過對不同溶劑提取的5種核桃花粉浸膏提取物中總酚含量的測定（圖1）可知，甲醇提取物的總酚含量明顯高于水提取物和乙醇提取物的總酚含量。表明核桃花粉中酚類化合物在甲醇中的溶解度較其余兩種溶劑大，這可能由于以黃酮為主的多酚類物質(zhì)屬弱極性分子，根據(jù)相似相溶原理，溶液極性與被提取物質(zhì)極性相近更有利于醇溶性和水溶性的多酚類物質(zhì)的最大程度析出[14]，使含量達到最高。從圖1還可看出，除香玲品種外，其余4種核桃花粉的水提取物的總酚含量與乙醇提取物的總酚含量相近。西林2的水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物中總酚含量均高于其他4種核桃花粉對應的溶劑提取物中的總酚含量。

2.3 不同溶劑提取對核桃花粉還原能力的影響

從表2中可以看出，不同溶劑的5種花粉提取物對Fe3+的還原能力存在一定的差異。西林2、西扶2、香

玲、西洛3、西林3的還原能力大小順序均為：甲醇提取物＞乙醇提取物＞水提取物，這與總酚含量關系趨勢一致。比較5種不同的花粉提取物，其中西林2的甲醇提取物、乙醇提取物和水提取物的還原力均大于其他4種花粉相應提取物的還原力。香玲水提取物的還原力最弱。除香玲外，其余4種花粉乙醇提取物和水醇提取物的還原能力相近。綜合相關分析可得，不同種類核桃花粉提取物對Fe3+的還原能力與其總酚含量呈正相關，說明在此反應中促使Fe3+被還原的物質(zhì)主要是酚類物質(zhì)[15]。

表2 五種核桃花粉提取物的還原能力Table 2 The DPPH radical scavenging ability of 5 kinds ofwalnut staminate pollen extracts

在相同濃度條件下，5種核桃花粉提取物對Fe3+的還原能力均低于VC，其中西林2甲醇提取物還原力最強，吸光值為VC的1/8，香玲水提取物還原力最弱，僅為VC的1/18左右。

2.4 不同溶劑核桃花粉提取液對DPPH自由基清除能力的影響

圖2 五種核桃花粉對DPPH自由基的清除作用Fig.2 The DPPH radical scavenging ability of 5 kinds ofwalnut staminate pollen extracts

由圖2可知，5種核桃花粉提取物對DPPH自由基均有不同程度的清除作用，其中西林2花粉提取物對DPPH自由基清除能力最強。在同一濃度下，各種花粉對DPPH自由基的清除作用大小為：乙醇提取物＞甲醇提取物＞水提取物，表明其乙醇提取物和甲醇提取物具有較高的抗氧化能力，但水提取物對DPPH自由基的清除率相對較弱。除西扶2外，各種核桃花粉的甲醇提取物和乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力相近，均大于水提取物。這一結果與之前的多酚含量一致性不明顯，這可能是由于核桃花粉中還存在著多酚以外的且能溶于乙醇的抗氧化物質(zhì)，而對DPPH自由基的清除不止酚類物質(zhì)在起作用，還有其他抗氧化物質(zhì)在反應[16]。

2.5 不同溶劑提取對TBA抗脂質(zhì)氧化能力的影響

圖3 五種核桃花粉的TBA脂質(zhì)抗氧化能力Fig.3 The lipid antioxidant capacity of 5 kinds ofwalnut staminate pollen extracts

通過對圖3的分析表明，五種核桃花粉提取物對脂質(zhì)均有很好的抗氧化能力，但又有差異。就個別而言，除西扶2外其他品種花粉提取液抗脂質(zhì)能力都相差不大，且均高于西扶2，這與五個品種核桃花粉中所含總酚含量關系相吻合；五個花粉品種醇類提取液的抗氧化能力均明顯高于水提取液的抗氧化能力，這和其對DPPH自由基的清除能力規(guī)律相互印證。由此可以得出，核桃花粉的抗脂質(zhì)氧化作用，受品種影響較大，與其總酚含量，還原能力[17]等因素相關。

3 結論

通過以上實驗可以看出，核桃花粉提取物抗氧化能力較強，但不同品種之間及不同溶劑的提取物之間的差異較大：5個核桃花粉品種中提取物酚類化合物含量最高的是西林2號，不論對Fe3+的還原能力、DPPH自由基清除力還是TBA抗脂質(zhì)氧化能力都較其他品種強，因此應當選取西林2號作為高檔保健品和化妝品核桃的花粉原料的首選品種；甲醇溶液對花粉中酚類物質(zhì)的提取率高，提取液的抗氧化能力強，應當選取甲醇溶液作為核桃花粉提取溶劑。

[1]郗榮庭.發(fā)揮優(yōu)勢，扭轉劣勢，加快核桃產(chǎn)業(yè)化步伐[M].第二屆中國核桃大會暨首屆商洛核桃節(jié)論文集.楊凌：西北農(nóng)林科技大學出版社，2009：7-10.

[2]葉正達.核桃雄花的利用[J].云南林業(yè)，2005，26（3）：21.

[3]Husen Jia，Yinong Xu.Walnut staminate flowers can be explored as a supplementary plant oil source[J].Journal of Integrative Plant Biology 2006，48（4）：377-380

[4]BONVEHF JS，TORRENT M S.Evaluation of polyphenolic and flavonoid compounds in honeybee-collected pollen produced in Spain[J].Agric Food Chemistry，2001，49（4）：1848-1853.

[5]SILVA TM S，CAMARA C A，F(xiàn)REITASBM，et al.Chemical composition and free radical scavenging activity of pollen loads from stinglessbee Melipona subnitida Ducke[J].Food Composition and Analysis，2006，19：507-511.

[6]LEJA M，MARECZEK A，WYZGOLIK G，et al.Antioxidative properties of bee pollen in selected plant species[J].Food Chemistry，2007，100（1）：237-240.

[7]ALMARAZ-ABARCA N，CAMPOSM G，CORRAL JH，et al.Antioxidant activity of polyphenolic extract of monofloralhoneybee-collected pollen from mesquite（Prosopis juliflora，Leguminosae）[J].Food Composition and Analysis，2007，20（2）：119-124.

[8]厲闐.蜂花粉抗氧化性的研究[D].西安：西北大學，2005.

[9]張德權，臺建祥，付勤.生物類黃酮的研究及應用概況[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25（6）：52-57.

[10]NIJVELDT R J，ELS VAN N，BOELENS P G，et al. Flavonoids：a review ofprobablemechanism ofaction and potential applications[J].American Journal of Clinical Nutrition，2001，34（23）：248-251.

[11]COOK NC，SAMMAN S.Flavonoids-chemistry，metabolism，cardioprotective effects，and dietary sources[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，1996，7（2）：66-76.

[12]俞秀玲，張杰.核桃花粉營養(yǎng)成分分析與評價[J].林業(yè)科技開發(fā)，2007，21（3）：45-47.

[13]曹煒，索志榮.Folin-Ciocalteu比色法測定蜂蜜中總酚酸的含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（12）：80-82.

[14]姚瑞祺.青果多酚的提取、分離及體外抗氧化活性研究[D].西安：陜西師范大學，2009.

[15]賈之慎，楊賢強.茶多酚抗氧化作用的研究與應用[J].食品科學，1990（11）：1-5.

[16]楊賢強，曹明富，沈生榮，等.茶多酚（TP）清除自由基和抗氧化作用的機理及應用基礎研究[J].中國茶葉加工，1994（1）：41-44.

[17]趙保路.茶多酚的抗氧化作用[J].科學通報，2002，47（16）：1206-1210.

Study on the antioxidant activity of walnut pollen extracts

WANG Dan，ZHAIM ei-zhi*，MAO Guang-rui，SHIGuan-zhao
（College of Forestry，Northwest A&FUniversity，Yangling 712100，China）

The antioxidant properties of five different walnut pollen extracts （Xilin 2，Xilin 3，Xifu 2，Xiluo 3 andXiangling） were assayed. The antioxidant activity of methanolic，ethanolic and water extracts were determinedusing different methods including reducing power ，iron （II ） chelation ，DPPH radical scavenging ，anti-lipidoxidation andthe total phenolic contents evaluation. The results showed that statistically significant relationshipbetween the total phenolic content and the reducing power assay ，iron（II） chelation assay. The order wasmethanolic＞ethanolic＞water. The ability of DPPH radical was Ethanolic＞methanolic＞water. The water extractedfrom walnut staminate pollen showed higher TBA activities. Xilin 2 pollen extracts showed the highest scavengingactivity for DPPH radicals and Xilin 3 water extracts showed the highest TBA activities.

walnut pollen；extracts；antioxidantion

TS255.6

：A

：1002-0306（2014）16-0137-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.022

2013-11-06 *通訊聯(lián)系人

王丹（1988-），女，碩士研究生，研究方向：林產(chǎn)化學加工工程。

國家林業(yè)局《保健功能性核桃產(chǎn)業(yè)化開發(fā)技術研究》公益性行業(yè)專項（201004027）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃（2012KTZB02-01-01）。