黑果枸杞與5種果蔬中花色苷組成及體外抗氧化活性比較

閆亞美，代彥滿，冉林武，曹有龍，羅 青，李曉鶯，秦 墾，戴國(guó)禮，曾曉雄

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川750002；3.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南三門峽472000；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，寧夏銀川750004）

黑果枸杞與5種果蔬中花色苷組成及體外抗氧化活性比較

閆亞美1，2，代彥滿3，冉林武4，曹有龍2，羅 青2，李曉鶯2，秦 墾2，戴國(guó)禮2，曾曉雄1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川750002；3.三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南三門峽472000；4.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，寧夏銀川750004）

目的：評(píng)價(jià)黑果枸杞等6種不同花色苷來源的植物材料的花色苷組成含量及體外抗氧化活性，為花色苷的利用和具有較強(qiáng)抗氧化活性植物資源的篩選提供參考。方法：取黑果枸杞等6種不同花色苷來源的植物材料，采用分光光度法、HPLC-MS法分析測(cè)定黑果枸杞花色苷含量及主要組成，用DPPH、ABTS和FRAP法分析其體外抗氧化活性。結(jié)果：黑果枸杞等6種不同花色苷來源的植物材料總花色苷含量的變化幅度為0.21～2.26mg/g鮮果。其中黑果總花色苷含量最高，花色苷含量分別是葡萄、樹莓、紫甘藍(lán)、藍(lán)莓和紫薯的10.72、4.91、1.91、1.75、4.45倍。黑果枸杞花色苷的主要組分為矮牽牛素衍生物，有別于其他所測(cè)果蔬材料，其抗氧化活性也最高。結(jié)論：較之5種花色苷含量較高的天然果蔬材料，黑果枸杞中花色苷主要組分與之差異很大，總花色苷含量和抗氧化活性總體都較高，是較好的開發(fā)功能性食品的資源。

黑果枸杞，果蔬，花色苷，抗氧化活性

枸杞是我國(guó)受原產(chǎn)地保護(hù)的藥食兩用類材料和傳統(tǒng)出口創(chuàng)匯產(chǎn)品。寧夏是枸杞的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，枸杞種質(zhì)資源極為豐富。黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科（Solanceae）枸杞屬（Lycium L.）植物，果實(shí)黑色，是近年來新發(fā)掘的多年生耐鹽、抗旱野生枸

杞資源。分布于寧夏、新疆、西藏、青海、內(nèi)蒙、甘肅等地。其成熟漿果中富含花色苷[1-2]，具有抗氧化、潛在預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)疾病等作用[1，3]。

氧化應(yīng)激是許多慢性退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制。探尋和研究具有抗氧化活性的天然植物化合物用于防治衰老相關(guān)的多種疾病，如阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化等，成為醫(yī)藥、植物化學(xué)等多個(gè)學(xué)術(shù)領(lǐng)域共同關(guān)注的課題。

花色苷是含多個(gè)酚羥基的黃酮類化合物。大量體內(nèi)外研究表明，花色苷通過其較強(qiáng)的抗氧化清除自由基作用[4-7]，顯示出抗炎、保護(hù)心血管、抗腫瘤等多種生物活性。因此許多富含花色苷的物質(zhì)如藍(lán)莓、葡萄皮等在國(guó)外已經(jīng)得到了開發(fā)利用。黑果枸杞富含花色苷類活性成分，是近年來新挖掘的的野生資源，研究表明，花色苷等多酚類活性物質(zhì)是其發(fā)揮保健作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3]。

不同類型花色苷因所含羥基數(shù)量、位置及結(jié)合糖基種類的不同，其抗氧化活性有較大差異[8]。植物中的花色苷組成與植物的種類息息相關(guān)，不同植物其花色苷的組成及含量不同。黑果枸杞花色苷與其他果蔬的花色苷組成、活性是否存在差異，國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道鮮見。

本文比較并評(píng)價(jià)了黑果枸杞等6種不同花色苷來源植物材料的花色苷組成、含量及體外抗氧化活性，為花色苷的利用和具有較強(qiáng)抗氧化活性植物資源的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞鮮果 采摘于國(guó)家枸杞工程技術(shù)研究中心資源圃；其他新鮮果蔬 購(gòu)于市場(chǎng)；采集或采購(gòu)的果蔬 于-23℃保存；DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS（2，2’-azinobis（3-ethylbenzenothiazoline-6-sulfonic））、TPTZ（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine）、VC、Folin-Ciocalteu試劑 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；色譜純甲醇、三氟乙酸 購(gòu)自MREDA公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀（G1379A脫氣機(jī)，G1311A泵，G1316A柱溫箱，G1314A VWD檢測(cè)器）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)、安捷倫；RE-5286型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；UV755B型紫外可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 準(zhǔn)確稱取50g各種采集或采購(gòu)果實(shí)，粉碎，用0.5%TFA甲醇溶液1000m L提取30m in，過濾后收集濾液。濾渣用相同提取工藝提取2次。濾液合并后于38℃減壓蒸干。然后用0.5%TFA溶解并定容至100m L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 花色苷含量測(cè)定 紫外分光光度計(jì)在250～600nm范圍掃描，分別測(cè)定各種不同提取物花色苷在pH 4.5和pH 1.0緩沖液中的最大吸收波長(zhǎng)及其最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值A(chǔ)[2]?？偦ㄉ蘸浚ㄒ允杠嚲账?3-葡萄糖苷計(jì)）的計(jì)算公式：

總花色苷含量（mg/g）=（C×V）/M （3）

式中，A：最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值；MW：矢車菊-3-葡萄糖的分子質(zhì)量（449.2g/mol）；DF：待測(cè)液稀釋倍數(shù)；ε：消光系數(shù)（29600L/mol·cm）；l：光路長(zhǎng)度（cm）；C：花色苷質(zhì)量濃度（mg/L）；V：待測(cè)液的體積（m L）；M：樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 黑果枸杞活性成分分離、鑒定

1.2.3.1 色譜條件的選擇 色譜柱：TSKgel ODS-80TSQA色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Tosoh）。流動(dòng)相A：1%甲酸+0.1%三氟乙酸水溶液；B：15%甲醇乙腈溶液。流速：0.8m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)530nm；柱溫35℃。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradientelution requirementby HPLC

1.2.3.2 黑果枸杞花色苷提取及HPLC分離 取5.000g鮮黑果枸杞，加200m L 0.5%三氟乙酸甲醇溶液，勻漿，4℃下避光浸漬提取24h，4000r/m in離心10m in，過濾，取上清液，用0.45μm濾膜過濾，定容至200m L。過0.45μm濾膜后吸取20μL進(jìn)樣，采用1.2.3.1方法洗脫條件進(jìn)行分離。

1.2.3.3 黑果枸杞花色苷HPLC-MS分離鑒定 黑果枸杞多酚類物質(zhì)HPLC分析條件同上。MS分析條件如表2所示。

表2 黑果枸杞多酚類物質(zhì)MS分析條件Table 2 MS anaysis condition of anthocyanins of Lycium ruthenicum Murr

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參照Liu等[9]略作改動(dòng)，吸取待測(cè)溶液0.5m L，加入0.14mmol/L DPPH溶液4.0m L，用60%乙醇定容至6m L搖勻，放置30m in。以60%乙醇調(diào)零，測(cè)定517nm處的吸光度A樣品（加樣后）。同時(shí)，以不加樣品的DPPH溶液4.0m L，用60%乙醇定容至6m L的混合液在517nm處的吸光度A為對(duì)照（加樣前）。DPPH·清除率（%）=（A加樣前-A加樣后）/A加樣前× 100。以VC溶液清除DPPH自由基清除率作標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=6.861X-1.0168，R2=0.9946），各種果蔬提取物清

除DPPH能力表示為VC當(dāng)量（mg/g），即每克樣品抗氧化能力相當(dāng)于VC的毫克數(shù)。

1.2.5 總抗氧化能力測(cè)定 總抗氧化能力（Trolox Equivalent antioxidant Capacity，TEAC）參照Arts等[10]的方法略作改動(dòng)。將5m L 7mmol/L ABTS+·和88μL 140mmol/L過硫酸鉀混合，形成ABTS儲(chǔ)備液，避光保存，使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃、734nm波長(zhǎng)下吸光度為0.7±0.02。取300μL不同濃度待測(cè)液，空白管加入100μL 80%乙醇，最后加入3.7m L ABTS工作液，振蕩30s，室溫下靜置6m in后，在734nm處測(cè)吸光值變化。按下式計(jì)算ABTS+·清除率：

ABTS+·清除率（%）=1-（Ai-Aj）/A0×100

式中：Ai為加入待測(cè)液的吸光值；Aj為待測(cè)液的本底值；A0為不加待測(cè)液的對(duì)照值。IC50為對(duì)ABTS+·清除率達(dá)到50%時(shí)的樣品濃度。另以不同濃度VC做清除ABTS+·的曲線（Y=0.0213X+0.5417，R2=0.9908）?？寡趸芰Ρ硎緸閂C當(dāng)量（mg/g），即每克樣品抗氧化能力相當(dāng)于VC的毫克數(shù)。

1.2.6 FRAP值測(cè)定 采用Benzie等[11]的方法略有改動(dòng)。TPTZ工作液的配制：取10mmol/L TPTZ溶液10m L，0.3mol/L醋酸鈉緩沖液（pH=3.6）100m L，20mmol/L的FeCl3溶液10m L混合均勻后置于35℃水浴中孵化30m in后使用，即用即配。測(cè)定時(shí)取樣品液0.1m L，加入TPTZ工作液0.9m L，醋酸鈉緩沖液9m L，于35℃水浴中反應(yīng)30m in，597nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以VC溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=0.0623X+0.0769，R2=0.9923），抗氧化能力表示為VC當(dāng)量（mg/g），即每克樣品抗氧化能力相當(dāng)于VC的毫克數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003、SPSS 16.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果蔬花色苷組成及含量比較

如表3所示，所選的6種富含花色苷活性物質(zhì)的果蔬中，與前人研究比較，本文測(cè)定的不同果蔬花色苷含量大都在前人測(cè)定的范圍之內(nèi)，其中，黑果枸杞（1.60～6.25mg/g）[1，3]、藍(lán)莓（大多品種含量介于0.95～2.02mg/g）[12]、樹莓（0.3～0.6mg/g）[13-14]、紫甘藍(lán)測(cè)定結(jié)果略高于劉玉芹等的測(cè)定結(jié)果（0.36mg/g）[15-16]、葡萄低于A lleye等的測(cè)定結(jié)果（0.40～0.70mg/g）[17]、紫薯（0.41mg/g）[16，18]。各種果蔬花色苷含量差異較大，其中，黑果枸杞花色苷含量最高，藍(lán)莓次之，葡萄和樹莓中含量最小。黑果枸杞花色苷含量分別是葡萄、樹莓、紫甘藍(lán)、藍(lán)莓和紫薯的10.72、4.91、1.91、1.75、4.45倍?？梢姡诠坭礁缓ㄉ疹愇镔|(zhì)。

2.2 黑果枸杞花色苷主要組分分離鑒定

HPLC-MS法是目前花色苷分離鑒定的主要方法之一，主要依據(jù)色譜的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息包括分子量信息等，參照文獻(xiàn)信息進(jìn)行化合物的鑒定。黑果枸杞花色苷色譜分離效果如圖1（530nm）及圖2所示，HPLC-VAD-MS分離鑒定的黑果枸杞花色苷分子量、保留時(shí)間及碎片離子信息如圖1、圖2所示。矮牽牛素的m/z數(shù)分別為317，根據(jù)參考文獻(xiàn)的質(zhì)譜信息[3]，圖1中，峰5初步鑒定為花色苷，且具有苷元矮牽牛素（317m/z），表明其為矮牽牛素衍生物，高分子量表明其極可能為?；ㄉ?。根據(jù)ZhengJie報(bào)道[3]，峰5鑒定為矮牽牛素-3-O-蕓香糖（反式-p-coumaroyl）-5-O-葡萄糖苷。因此，結(jié)合表3中文獻(xiàn)資料信息，黑果枸杞主要花色苷組成有別于其他所測(cè)果蔬。

圖1 黑果枸杞花色苷HPLC圖Fig.1 HPLC profile of anthocyanins（530nm）of Lycium ruthenicum Murr

圖2 Peak 5化合物質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of Peak 5

2.3 體外抗氧化活性比較

表3 不同果蔬花色苷含量及特征組分Table 3 The compositions and contents of anthocyanins in different fruitand vegetables

2.3.1 DPPH·清除作用 從表4可以看出，6種樣品的DPPH·清除力之間，均具有顯著性差異（p＜0.05），大小順序?yàn)楹诠坭剑酒咸眩緲漭舅{(lán)莓＞紫甘藍(lán)＞紫薯。黑果枸杞DPPH清除力均大于其他5種材料。

2.3.2 總抗氧化能力 從表4可以看出，6種樣品的ABTS+·清除力之間均具有顯著性差異（p＜0.05），大小順序?yàn)槠咸眩竞诠坭剑舅{(lán)莓＞紫甘藍(lán)＞樹莓＞紫薯。除葡萄外，黑果枸杞ABTS清除力均大于其他4種材料。

2.3.3 FRAP值 從表4可以看出，6種樣品的FRAP值之間，均具有顯著性差異（p＜0.05），大小順序?yàn)槠咸眩竞诠坭剑緲漭舅{(lán)莓＞紫甘藍(lán)＞紫薯。除葡萄外，黑果枸杞FARP值均大于其他4種材料。

表4 不同果蔬花色苷體外抗氧化活性Table 4 In vitro antioxidantactivity of anthocyanins extracted from different fruits and vegetables

3 結(jié)論

比較5種花色苷含量較高的天然果蔬材料，黑果枸杞中花色苷主要組分為矮牽牛素，有別于其他果蔬花色苷構(gòu)成；黑果枸杞總花色苷含量最高，分別是是葡萄、樹莓、紫甘藍(lán)、藍(lán)莓和紫薯的10.72、4.91、1.91、1.75、4.45倍。體外抗氧化活性測(cè)試表明，黑果枸杞DPPH自由基清除能力、FRAP值、總抗氧化活性大都居首，表明其具有很好的抗氧化活性。較高的花色苷含量及較好的抗氧化活性揭示，黑果枸杞可作為較好的開發(fā)功能性食品的資源。對(duì)于其不同于其他果蔬的花色苷組成成分、及其構(gòu)效關(guān)系等，有待于進(jìn)一步研究。

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Composition and in vitro antioxidant activity of anthocyanins extractedfrom Lycium ruthenicum Murr.，different fruits and vegetables

YAN Ya-mei1，2，DAIYan-man3，RAN Lin-wu4，CAO You-long2，LUO Qing2，LIXiao-ying2，QIN Ken2，DAIGuo-li2，ZENG Xiao-xiong1，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095，China；2.NationalWolfberry Engineering Research Center，Yinchuan 750002，China；3.San Men Xia Polytechning，Sanmenxia 472000，China；4.Laboratory Animals Center，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective：The aim of this study was to evaluate total anthocyanins and in vitro antioxidant activity ofextracts from 6 kinds of plants such as Lycium ruthenicum Murr. and so on，and to provide a basis for exploitationof anthocyanins and to sift strong antioxidant activity resources. Methods：Total of 6 different fruits and vegetableswas evaluated in the study. The total contents of anthocyanins were measured using spectrophotometermethods. Composition of the polyphenol extracts was also analyzed using HPLC and HPLC-MS. DPPH，ABTS，and FRAP methods were used to evaluate in vitro antioxidant activity of the fruits and vegetables. Results：Totalanthocyanins of 6 different fruits and vegetables were 0.21～2.26mg/g fresh fruits. Comparatively ，the totalanthocyanins content of Lycium ruthenicum Murr. was 10.72，4.91，1.91，1.75，4.45 times higher than that ofgrapes，raspberry，purple cabbage，bule berry and purple potato，and the main anthocyanins composition ofLycium ruthenicum Murr. was petunidin derivative which was different from the fruits and vegetables in ourtested paper. Lycium ruthenicum Murr. had the highest value of total anthocyanins content and in vitroantioxidant activity. Conclusion：Compared with the 5 kinds of fruits and vegetables tested in the study，Lyciumruthenicum Murr. had the highest value of total anthocyanins content and in vitro antioxidant activity，it was asource with rich anthocyanins，and one kind of good resources for development of healthy food.

Lycium ruthenicum Murr.；fruits and vegetables；anthocyanins；antioxidant activity

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0133-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.021

2013－10－23 *通訊聯(lián)系人

閆亞美（1982-），女，博士研究生，助理研究員，主要從事枸杞功效成分方面的研究。

寧夏回族自治區(qū)自然基金（NZ13101，NZ13128）；寧夏農(nóng)林科學(xué)院院自選項(xiàng)目（NKYQ-13-01，NKYC-13-04）。