一氧化氮合酶基因多態(tài)性與青年缺血性卒中的關(guān)系研究

史從寧，王雅杰，趙運(yùn)轉(zhuǎn)，康熙雄

在世界范圍內(nèi),缺血性卒中是主要的致死性疾病，其在青年人(15～45歲)中的發(fā)病率為3%～5%[1-2]。近年來有一些針對(duì)青年缺血性卒中發(fā)生機(jī)制的研究，凝血因子Ⅴ的Leiden突變、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T的多態(tài)性均被認(rèn)為可能與青年缺血性卒中的發(fā)生相關(guān)[3-4]。內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶能生成一氧化氮，一氧化氮在血管動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)方面起重要作用。一氧化氮是強(qiáng)血管擴(kuò)張劑并能抑制血小板的聚集[5-6]。有試驗(yàn)表明，一氧化氮依賴的血管擴(kuò)張活性受損在缺血性卒中的發(fā)生中起重要作用[7-8]。盡管做過一些研究，一氧化氮合酶的基因多態(tài)性和缺血性卒中的相關(guān)性仍不確定，尤其早發(fā)性缺血性卒中研究更少，一氧化氮合酶基因多態(tài)性和青年缺血性卒中的關(guān)系值得研究。本研究檢測(cè)一氧化氮合酶內(nèi)含子4(eNOS4)、MTHFR C677T、凝血因子Ⅴ G1691A的多態(tài)性，探討其與青年缺血性卒中的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年4月—2012年7月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院收治的青年缺血性卒中患者97例為研究組，其中男79例，女18例；年齡20～45歲。患者突然發(fā)病，迅速出現(xiàn)局限性神經(jīng)功能缺失癥狀并持續(xù)24 h以上，神經(jīng)癥狀和體征可以用某一血管綜合征解釋，顱腦CT或MRI發(fā)現(xiàn)梗死灶，梗死灶位于某一腦血管支配區(qū)域，排除腦出血、炎癥性疾病等，即可確診缺血性卒中。另同時(shí)期遵循年齡、性別頻數(shù)匹配的原則，選擇來自骨外科、普外科、消化內(nèi)科、呼吸內(nèi)科等其他科室的非缺血性卒中住院患者99例為對(duì)照組，排除心腦血管疾病，其中男80例，女19例；年齡21～45歲。入組患者均經(jīng)過全面系統(tǒng)的檢查，有詳細(xì)的病史和個(gè)人史資料。

1.2 臨床資料收集 收集患者性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒情況，檢測(cè)膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平、eNOS4、MTHFR C677T、凝血因子Ⅴ G1691A基因的多態(tài)性。

1.3 主要試劑和方法 基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Taq酶、dNTP、20 bp DNA marker、50 bp DNA marker、DL 2000 DNA marker內(nèi)切酶Hinf I均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；內(nèi)切酶Mnl I購(gòu)自NEB公司，引物由上海英駿公司合成；無水乙醇、冰乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；瓊脂糖購(gòu)自genetech公司；Tris堿購(gòu)自索萊寶公司。

基因組DNA提取嚴(yán)格按照說明書操作。eNOS4多態(tài)性測(cè)定由PCR完成，選用引物5′-AGCCCAGTAGTGAAGACCTGGTTAT-3′和5′-ACTCTTTGGCGGCCAGTGAT-3′，反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min變性，35個(gè)循環(huán)94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，得到491 bp(4a)和518 bp(4b)的產(chǎn)物。

MTHFR C677T多態(tài)性檢測(cè)首先進(jìn)行PCR反應(yīng)，選取引物5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′和5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min變性，35個(gè)循環(huán)94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，用Hinf I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后用4%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，得到198 bp的為C等位基因，得到175 bp和23 bp的為T等位基因。

凝血因子Ⅴ G1691A多態(tài)性檢測(cè)首先進(jìn)行PCR反應(yīng)，選取引物5′-TTTCAGGCAGGAACAACA-3′和5′-CTTCGGCAGTGATGGTAC-3′,反應(yīng)條件為 94 ℃ 5 min變性，35個(gè)循環(huán)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min，得到424 bp的PCR產(chǎn)物，用Mnl I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后用4%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，G1691G型得到3個(gè)片段(167、220、37 bp),G1691A型得到2個(gè)片段(167、257 bp)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和研究組臨床資料比較 對(duì)照組與研究組性別、年齡及HDL水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組高血壓檢出率、糖尿病檢出率、吸煙率、飲酒率及膽固醇、三酰甘油、LDL水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 對(duì)照組和研究組臨床資料比較

注：HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；*為t值

2.2 對(duì)照組和研究組基因型分布比較 對(duì)照組與研究組eNOS4基因型分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組MTHFR C677T基因型分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)；兩組凝血因子Ⅴ基因型均為1691GG。

表2 對(duì)照組和研究組基因型分布比較(例)

Table2 Comparison of distribution of genotypes between control group and study group

組別例數(shù)eNOS4bb abMTHFRC677TTT CT CC對(duì)照組998118344520研究組97907294523χ2值52940586P值00210746

注：eNOS4=一氧化氮合酶內(nèi)含子4，MTHFR=亞甲基四氫葉酸還原酶

2.3 青年缺血性卒中發(fā)生的影響因素 以是否發(fā)生缺血性卒中為因變量,以高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒(是=1，否=0)、血清膽固醇、三酰甘油、LDL水平(實(shí)測(cè)值)、eNOS4基因型(eNOS4 bb=1，eNOS4 ab=0)為自變量。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，高血壓、糖尿病、吸煙、LDL水平、eNOS4基因型與青年缺血性卒中發(fā)生有回歸關(guān)系(P<0.05,見表3)。

表3 青年缺血性卒中發(fā)生影響因素的多因素Logistic回歸分析

Table3 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors for the occurrence of ischemic stroke in young people

變量βSEWaldχ2值P值OR值95%CI高血壓187704192007600016532(2874，14846)糖尿病12920611447000343640(1099，12056)吸煙11340400804400053108(1420，6804)飲酒01370389012407251147(0535，2457)膽固醇-08360507272309900433(0160，1170)三酰甘油02340256084003591264(0766，2086)LDL14090606540000204094(1247，13438)eNOS4基因型15650603673200094782(1466，15593)

3 討論

缺血性卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率、高致死率且高復(fù)發(fā)率的疾病，是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的三大疾病之一，2008年我國(guó)第三次死亡原因回顧性抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，腦血管疾病已經(jīng)超過惡性腫瘤和心血管疾病，成為我國(guó)居民第1位死亡原因[9]。近年來國(guó)內(nèi)外研究均表明,缺血性卒中有年輕化的趨勢(shì),尤其是青年(18～45歲) 缺血性卒中發(fā)生有逐年增加的態(tài)勢(shì)。流行病學(xué)相關(guān)調(diào)查表明，青年卒中占全部人群卒中的9.77%,以缺血性卒中為主,男性患者居多[10]。有研究顯示，青年缺血性卒中最主要的原因是早發(fā)性動(dòng)脈硬化(20%～30%)，高血壓以及不良的生活習(xí)慣和嗜好(吸煙、飲酒)是動(dòng)脈粥樣硬化主要危險(xiǎn)因素[11-12]。有研究在尸檢中也證實(shí)在15～19歲意外死亡者中主動(dòng)脈已經(jīng)出現(xiàn)粥樣硬化的早期病理改變[13]。隨著年齡增長(zhǎng)其他高危因素如高血脂、糖尿病等發(fā)病率上升也可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),青年缺血性卒中患者中高血壓檢出率較對(duì)照組高，與李裕茂[14]報(bào)道的高血壓是形成青年腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素相一致，同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病患病率、吸煙率、飲酒率、脂代謝指標(biāo)的水平在研究組和對(duì)照組間均存在差異。

在缺血性卒中的發(fā)病過程中，遺傳因素也起了很大的作用，對(duì)缺血性卒中基因的研究大多采用候選基因法，與青年缺血性卒中有關(guān)的候選基因包括血小板相關(guān)基因、凝血/纖溶基因、脂代謝基因、同型半胱氨酸代謝基因和其他基因。高凝狀態(tài)被認(rèn)為是青年缺血性卒中的最重要危險(xiǎn)因素，在所有能導(dǎo)致高凝狀態(tài)的危險(xiǎn)因素中，凝血因子Ⅴ的Leiden突變是青年缺血性卒中最危險(xiǎn)的基因多態(tài)性[15-16]。凝血因子V基因1691位點(diǎn)G被A所取代，使活化蛋白C裂解活化凝血因子V的位點(diǎn)消失，導(dǎo)致活化凝血因子V對(duì)活化蛋白C產(chǎn)生抵抗，從而導(dǎo)致血栓前狀態(tài)。MTHFR的C677T多態(tài)性能導(dǎo)致血清同型半胱氨酸水平升高，也被認(rèn)為是青年缺血性卒中的危險(xiǎn)因素[17]。半胱氨酸在體內(nèi)通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫化2種途徑代謝，代謝的關(guān)鍵酶分別是MTHFR和胱硫醚β-合成酶(CBS)，酶活性的下降是導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥的常見危險(xiǎn)因素。MTHFR基因定位于染色體1p36.3，其C667T純合突變使酶活性下降。研究認(rèn)為，MTHFR的基因突變與青年人缺血性卒中有關(guān)，但目前仍存在爭(zhēng)論[18]。內(nèi)皮源性一氧化氮合酶(eNOS)水解L-精氨酸產(chǎn)生內(nèi)皮源性一氧化氮(eNO)[19]。研究發(fā)現(xiàn)eNO在多種生理過程中以自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮著重要作用，包括維持腦的基礎(chǔ)血流量、維持腦血管的舒張和自動(dòng)調(diào)節(jié)[20]，保持血管的完整性，抑制平滑肌增殖[21]。一氧化氮合酶的基因多態(tài)性可導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，也和缺血性卒中相關(guān)，但和青年缺血性卒中的關(guān)系還不明確。

在本研究中選取青年缺血性卒中患者，年輕人受外界危險(xiǎn)因素作用的時(shí)間短，發(fā)生疾病時(shí)基因起的作用要重要，方便找到該疾病的易患基因，其次是由于青年缺血性卒中的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，這帶來了沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。結(jié)果顯示凝血因子Ⅴ1691GG未檢測(cè)到突變型。這一結(jié)果說明凝血因子Ⅴ的Leiden突變不能作為中國(guó)青年缺血性卒中的危險(xiǎn)因素。與其他研究結(jié)果不一致，其原因可能是由于種族特異性[3]。MTHFR 677TT基因型和血清同型半胱氨酸水平升高相關(guān)，升高的血清同型半胱氨酸水平可損壞內(nèi)皮基質(zhì)導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂[22]。但在本研究中，MTHFR 677TT基因型在研究組和對(duì)照組間無差異，不支持MTHFR 677TT基因型作為中國(guó)青年缺血性卒中的危險(xiǎn)因素。eNOS4基因型在研究組和對(duì)照組間的分布有差異，對(duì)照組eNOS4 ab基因型的攜帶者比研究組多,與Hassan等[23]的研究結(jié)果相符。在Hassan等[23]的研究中還發(fā)現(xiàn)eNOS4 ab基因型和更高的一氧化氮水平相關(guān)。這種內(nèi)含子的插入缺失多態(tài)性和疾病相關(guān)可能是由于其影響了mRNA的穩(wěn)定性和酶水平。

總之，本研究結(jié)果eNOS4 bb基因型作為中國(guó)青年缺血性卒中的重要基因危險(xiǎn)因子和以往的研究結(jié)果認(rèn)為凝血因子Ⅴ的Leiden突變或其他易栓基因多態(tài)性是青年缺血性卒中的重要基因危險(xiǎn)因子是不同的。提示內(nèi)皮功能紊亂也許在青年缺血性卒中中發(fā)揮重要作用，尤其在中國(guó)人群中。但由于本研究樣本量較小，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本行長(zhǎng)期研究。

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