基于多指標(biāo)分析的不同產(chǎn)地梔子質(zhì)量研究

陳家棟， 姜武， 黃宗貴， 李亞萍， 段曉婧， 林慶業(yè)， 陶正明*

(1.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005； 2.溫州市種子站，浙江 溫州 325005；3.永嘉縣科興林業(yè)種苗場，浙江 永嘉 325100)

梔子也稱黃梔子、紅枝子等，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是茜草科的一種常綠灌木，主要產(chǎn)地為浙江、江西、湖南等[1]。梔子果實在每年9 —11月成熟，果實顏色呈紅黃色時采收最佳[2]。梔子中主要有效成分為梔子苷、西紅花苷、有機酸等，相關(guān)藥理研究表明，梔子具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽、改善記憶、抗血栓、降血糖等作用[3]。

由于各個產(chǎn)地的土壤、光照、水分等環(huán)境因素的不同，梔子果實物理特性和內(nèi)在次生代謝產(chǎn)物的累積都會存在差異。費曜等[4-5]對重慶、江西、四川、湖南4個產(chǎn)地梔子的植物特征、藥材性狀、活性成分及其他常規(guī)檢測進行比較，確定贛產(chǎn) 3 號為品質(zhì)最優(yōu)；曹虹虹等[3]比較了浙江、四川、福建、江西4個省份所產(chǎn)的梔子質(zhì)量，明確梔子果實中成分總含量從高到低依次為浙江>福建>江西>四川。2020版《中國藥典》規(guī)定，梔子苷含量是考察梔子質(zhì)量的明確指標(biāo)，然而，這種單一指標(biāo)并不能完整反映梔子果實的品質(zhì)和不同產(chǎn)地梔子的質(zhì)量差異。本課題組收集了6個省份的梔子果實樣品，對梔子果實物理指標(biāo)進行分析。利用高效液相色譜對梔子的主要成分進行測定，并建立指紋圖譜，結(jié)合相似度分析、主成分分析(PCA)、聚類分析(HCA)對不同產(chǎn)地梔子果實進行全面比較和分類，為梔子藥材的質(zhì)量評鑒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用梔子藥材分別采收于江西金溪、貴州德江、湖南瀏陽、四川資中、湖北武漢和浙江溫州，經(jīng)浙江省亞熱帶作物研究所陶正明研究員鑒定為茜草科植物梔子(Garadeniajasminoides)的成熟果實。質(zhì)量符合2020版《中國藥典》規(guī)定。

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Allegra 64R高速冷凍臺式離心機(美國BECKMAN公司)。梔子苷(DST170103-032)、西紅花苷Ⅰ(DST170411-011)、西紅花苷Ⅱ(DST170720-012)購于成都德思特生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙醇均為色譜級(Sigma-Aldrich公司)；試驗用水為娃哈哈飲用純凈水。

1.2 試驗方法

1.2.1 梔子果實物理性狀測定

現(xiàn)場采集梔子樣品，用便攜式天平現(xiàn)場稱量鮮果質(zhì)量，隨后送至實驗室檢測其余指標(biāo)。果實長度和直徑采用游標(biāo)卡尺測定，同批樣品檢測6個。

1.2.2 梔子果實水分、灰分、折干率測定

取各個產(chǎn)地梔子果實樣品3份，每份樣品2 g。根據(jù)2020版《中國藥典》中記載的水分(通則0832)和灰分(通則2302)的檢測方法，對不同產(chǎn)地的梔子水分和灰分的含量進行測定。折干率為每 100 g 鮮果實干燥后得到的干果的質(zhì)量，以百分比表示，重復(fù)5次。

1.2.3 利用HPLC檢測梔子果實主要成分

色譜條件。Waters HPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A相為水，B相為甲醇。梯度洗脫程序：0～15.0 min，30%B；15.01～28.0 min，30%B～100%B；28.01～30.0 min，100%B～30%B。柱溫30 ℃，流速0.5 mL·min-1。

對照品母液配置。精確稱取梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌贩勰?.1、7.2、3.2 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，對照品母液濃度為0.81、0.72、0.32 mg·mL-1。

對照品工作液配置。利用移液槍精確量取梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ母液1、0.25、0.1 mL，用甲醇定容至10 mL，獲得相應(yīng)對照品的工作液。

梔子測試樣溶液制備。精確稱取經(jīng)冷凍干燥后的梔子粉末0.1 g，放入具塞錐形瓶中，加入20 mL 75%甲醇，稱量并記錄其質(zhì)量。超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，放冷后再次稱定其重量，用75%甲醇補足減少的量，混勻，靜置后取上清液過濾，即得測試樣品。

線性關(guān)系考察。分別取1、2、4、8、10、15、20 μL所配置的標(biāo)準(zhǔn)樣品母液，制成不同質(zhì)量濃度的系列溶液進行檢測，分別以對照品進樣量(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)得不同標(biāo)樣相應(yīng)的回歸方程。

精密性、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察。精確吸取混合對照品溶液，按照色譜條件進行試驗，連續(xù)進樣6次，依次記錄試驗結(jié)果，進行儀器精密性考察。精確吸取浙江溫州產(chǎn)地的梔子藥材配置的溶液樣本，制備6份相同濃度的供試溶液，按照1.2.3節(jié)的色譜條件進行測試，記錄6次結(jié)果的特征圖譜，進行重復(fù)性考察。精確吸取浙江溫州產(chǎn)地的梔子藥材配置的溶液樣本，分別在0、2、4、8、12、24 h按照色譜條件進樣分析，記錄試驗結(jié)果，考察試驗樣本穩(wěn)定性。

1.2.4 梔子指紋圖譜研究

取不同產(chǎn)地的梔子藥材，進行樣本預(yù)處理，按色譜條件進樣分析，獲得梔子藥材的色譜圖，將其導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”，以浙江溫州產(chǎn)地樣本的平均值作為參照圖譜，采用平均數(shù)法，進行多點校正和色譜峰匹配，計算不同產(chǎn)地梔子的相似度。

1.2.5 PCA和 HCA

PCA是一種降維處理數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法，將大量相互聯(lián)系的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為少量的幾個正交的主成分變量，將信息從高維空間映射到低維的幾個主成分上[5]。在本研究中，為了明確6個產(chǎn)地梔子的差異，課題組根據(jù)梔子果實中梔子苷含量、西紅花苷Ⅰ含量、西紅花苷Ⅱ含量、果實質(zhì)量、果實含水量、果實灰分測試結(jié)果對6個產(chǎn)地梔子進行主成分分析。于此同時，本研究中將梔子果實相關(guān)檢測結(jié)果進行量化，導(dǎo)入SPSS 軟件中，采用 Ward 聯(lián)結(jié)法進行HCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地梔子果實物理指標(biāo)比較

由表1可知，產(chǎn)地為浙江溫州的梔子果實鮮重顯著高于其他5個產(chǎn)地的梔子，果實長度和果實直徑也顯著高于其他產(chǎn)地。結(jié)合梔子果實表型圖(圖1)，可以確定產(chǎn)地為浙江溫州的梔子果實在6個產(chǎn)地中是最大的。江西金溪所產(chǎn)梔子的果實鮮重、果實長度和果實直徑顯著低于其他5個產(chǎn)地。貴州德江、四川資中、湖北武漢梔子果實重量、長度、直徑差異不顯著。

圖中紅色標(biāo)尺為2 cm。A —江西金溪，B—貴州德江，C—湖南瀏陽，D—四川資中，E—湖北武漢，F(xiàn)—浙江溫州。

表1 不同產(chǎn)地梔子性狀比較

2.2 不同產(chǎn)地梔子水分、灰分、折干率比較

由表2可知，浙江溫州的梔子水分含量最低、折干率最高；產(chǎn)地為江西金溪的梔子灰分含量最低，其次是浙江溫州。

表2 梔子水分、灰分、折干率比較

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由表3可知，在相同色譜條件下，不同濃度梔子苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=1 399 605x-1 619，r=0.999 8，線性范圍在0.081～1.620 μg；西紅花苷Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=6 569 606x+6 010，r=0.999 5，線性范圍0.018～0.360 μg；西紅花苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=6 254 956x+2 891，r=0.999 1，線性范圍在0.003 2～0.064 0 μg，線性關(guān)系良好。

表3 對照品的線性回歸方程

2.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察

根據(jù)精密度試驗記錄色譜峰的峰面積，經(jīng)計算，梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為 0.36%、0.39%、0.34%，表明儀器的精密度良好。根據(jù)重復(fù)性試驗結(jié)果，梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ色譜峰面積的RSD分別為0.54%、0.48%、0.44%，表明該試驗方法的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性考察試驗結(jié)果顯示，梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的RSD分別為0.46%、0.59%、0.66%，表明試驗樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 不同產(chǎn)地梔子藥材含量比較

由表4可知，不同產(chǎn)地梔子主要成分含量差異較大，其中浙江溫州所產(chǎn)梔子中梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量均顯著高于其他產(chǎn)地的樣本，產(chǎn)地為江西金溪的樣本中梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ均為最低，其余4個產(chǎn)地的梔子樣本中這3種成分的含量高低不一。所檢測6個產(chǎn)地梔子藥材中梔子苷在6.60%～8.28%，西紅花苷Ⅰ在0.89%～1.63%，西紅花苷Ⅱ在0.15%～0.23%。6個產(chǎn)地3種成分總含量由高到低為浙江溫州>貴州德江>四川資中>湖南瀏陽>湖北武漢>江西金溪。江西金溪產(chǎn)地梔子的3種成分含量顯著低于其他產(chǎn)區(qū)。

表4 梔子中 3 種成分定量

2.6 指紋圖譜研究

由表5和圖2可知，浙江溫州所產(chǎn)梔子與其他5個省份所產(chǎn)梔子相似度均在0.97以上，說明不同產(chǎn)地梔子果實主要組成成分相似，因此通過相似度分析無法明確區(qū)分不同產(chǎn)地梔子區(qū)別。

圖2 梔子指紋圖譜

表5 梔子樣品相似度評價

2.7 主成分分析(PCA)和聚類分析(HCA)

由圖3可知，6個產(chǎn)區(qū)梔子主要可以分成4類。其中，產(chǎn)地為浙江溫州的梔子聚為一類，產(chǎn)地為湖南瀏陽、貴州德江、四川資中的梔子聚為一類，產(chǎn)地為江西金溪和湖北武漢的梔子各自聚為一類，分類趨勢較為明顯。

圖3 梔子PCA的得分

從圖4可以看出，當(dāng)判別距離為8時，這6個不同產(chǎn)地梔子可以分成4類。貴州德江、四川資中和湖南瀏陽梔子各方面性狀比較接近，因此聚為一類；浙江溫州、江西金溪、湖北武漢3個產(chǎn)地性狀差異較大，各自成一類。分類結(jié)果與主成分分析(PCA)結(jié)果一致。

圖4 梔子樣品聚類分析樹

3 討論

梔子廣泛分布于長江以南各個省份，不同區(qū)域之間存在較大的種內(nèi)自然變異，為更好地選育梔子優(yōu)良類型，充分發(fā)掘梔子種質(zhì)資源優(yōu)勢，對不同產(chǎn)地的梔子果實相關(guān)農(nóng)藝性狀及主要藥用成分進行分析評價。經(jīng)過對梔子果實物理性狀分析，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地梔子差異較大。產(chǎn)地為浙江溫州的梔子果實的鮮重、長度、直徑明顯優(yōu)于其他產(chǎn)地；經(jīng)HPLC檢測，浙江溫州梔子中的梔子苷、西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量也顯著多于其他產(chǎn)地。由此可以推測，產(chǎn)地為浙江溫州的梔子較其他產(chǎn)地梔子可能具有較優(yōu)良的遺傳基礎(chǔ)。

3.1 試驗條件優(yōu)化探索

本研究考察了超聲處理與回流提取這2種梔子藥用成分的提取方法，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)這2種提取方法均能有效提取出梔子中有效成分。然而，使用超聲處理的方法操作更為簡便，所花費時間較短，因此本試驗中利用超聲法提取。同時，比較了50%甲醇、75%甲醇、50%乙醇和75%乙醇作為溶劑的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75%甲醇作為溶劑時，提取效果最好，液相色譜圖上峰型最多且響應(yīng)較高，因此本試驗選擇75%甲醇作為溶劑對梔子藥材進行超聲提取。

近年來，不少學(xué)者從梔子農(nóng)藝性狀[6]和果實中主要成分[7-8]出發(fā)分析評價梔子品質(zhì)，然而，鮮有發(fā)現(xiàn)將梔子農(nóng)藝性狀與有效成分結(jié)合，系統(tǒng)性評價不同產(chǎn)地梔子品質(zhì)的報道。本試驗結(jié)合梔子物理性狀與主要成分分析，對不同產(chǎn)地梔子做出綜合性評價，確定產(chǎn)地為浙江溫州的梔子綜合表型最好，這也為梔子新品種選育提供了優(yōu)良的遺傳基礎(chǔ)。本研究中，課題組在2018—2020年連續(xù)采集不同產(chǎn)地的梔子，檢測梔子果實農(nóng)藝性狀及主要成分含量，結(jié)果顯示，3年的試驗結(jié)果相似，說明該結(jié)果真實可靠，具有可重復(fù)性。

3.2 不同產(chǎn)地聚類分析

本研究根據(jù)不同產(chǎn)地梔子的物理性狀和主要成分含量，利用主成分分析(PCA)和聚類分析(HCA)，確定6個產(chǎn)地梔子可以分為4大類。其中，貴州德江、四川資中和湖南瀏陽梔子大小相近，主要成分含量相似，因此聚為一類，推測可能是因為三地所產(chǎn)梔子親緣關(guān)系相近[9]生長環(huán)境相似導(dǎo)致。江西金溪所產(chǎn)相對較小主要成分含量較少，因此單獨聚為一類。浙江溫州和湖北武漢產(chǎn)梔子也各自聚為一類。這種聚類結(jié)果與劉聰?shù)萚10]對不同產(chǎn)區(qū)梔子的分類結(jié)果相類似。

3.3 建立系統(tǒng)性的梔子質(zhì)量評價體系

相關(guān)研究表明，不同采收時期[11]和加工模式[12-13]也會影響梔子中有效成分的含量，從而導(dǎo)致梔子品質(zhì)的差異。因此，在本試驗中不同產(chǎn)地梔子的采收時期和加工方式均保持一致。所以，為了綜合性評價梔子的藥材品質(zhì)，需規(guī)范化種植控制梔子質(zhì)量，結(jié)合藥材的外觀性狀與內(nèi)在成分，建立系統(tǒng)科學(xué)的梔子質(zhì)量評價體系，為后續(xù)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究提供參考，也將為規(guī)范化中藥市場，提升市場藥材品質(zhì)提供理論依據(jù)。