蠐螬質量標準研究

趙 磊,王路宏,孫艷濤

(1.四平市食品藥品檢驗所,吉林 四平136000；2.吉林師范大學 化學學院,吉林 四平136000)

蠐螬為金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子Holotrichia diomphaliaBates的干燥幼蟲[1]。民族藥中朝鮮族的習用藥材,朝藥圖志收載的功能主治具有破血、利水消腫,常用于太陰人跌打損傷、羸瘦腹?jié)M、癥瘕、經(jīng)閉、浮腫等病癥[2]。蠐螬收載于《中國藥典》2015版四部成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片項下,《中國藥典》2015年版一部中收載的大黃蟲丸、大黃蟲膠囊、大黃蟲片處方中均用到蠐螬[3-4]。

有文獻報道,蠐螬采用氨基酸為對照進行薄層色譜鑒別進行定性試驗[5]。但針對蠐螬薄層色譜鑒別采用傳統(tǒng)的展開劑展開后噴茚三酮顯色方法,經(jīng)過系統(tǒng)的試驗研究,發(fā)現(xiàn)采用調整展開劑比例并加入茚三酮作為展開劑系統(tǒng)的方法,能使方法展開效果更清晰,操作簡單。初步研究確定蠐螬中含有尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷等成分[6-7],而肌苷在《中國藥典》2015版二部收載的劑型有肌甘口服液、肌苷片、肌苷注射液、肌苷膠囊、肌苷葡萄糖注射液、肌苷氯化鈉注射液、注射用肌苷。肌苷用于白細胞或血小板減少癥,各種急慢性肝臟疾患、肺原性心臟病等心臟疾患；中心性視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等疾患[8]。而蠐螬具有破血祛瘀、散結通乳、明目等功效,用于胸肋瘀血疼痛、丹毒、瘡瘍、痔瘺、目中翳膜。肌苷與蠐螬治療作用具有相似性,含量控制應以肌苷為控制指標,具有專屬性。并且蠐螬的來源為春、夏二季捕捉,用沸水燙死,曬干或烘干。肌苷的性質具有水溶性,采用肌苷為目標測定成分,進行含量控制,亦能夠有效反映蠐螬來源處理方法的控制指標。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；2001B型系列超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)；電子天平BT125D型萬分之一分析天平(上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠制造)；SK5200 H超聲波清洗器(300 W 60 Hz,上?？茖x器有限公司)。

1.2 試藥

亮氨酸對照品批號：110876-200204,纈氨酸對照品批號：110874-201204,丙氨酸對照品批號：140680-201604,肌苷對照品(批號140669-201305；含量為99.1%；使用前不需干燥)均購于中國食品藥品檢定研究院；蠐螬(收集10批藥材,規(guī)定編號為qc1-qc10經(jīng)鑒定均為正品蠐螬)；乙醇、正丁醇、冰醋酸、茚三酮均為為分析純；甲醇為色譜純；水為超純水；色譜柱為Sepax BR-C18(4.6mm×250mm,5μm)。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別方法與結果

2.1.1 蠐螬對照藥材及供試品溶液制備 取蠐螬粉末0.5g,加稀乙醇10mL,超聲處理30min,濾過濾液作為供試品溶液。另取亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸對照品適量,加稀乙醇制成每1mL各含1mg的混合溶液,作為對照品溶液。

2.1.2 薄層色譜條件 照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2015版四部通則0502)試驗,吸取上述對照品溶液1μL、供試品溶液2～5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以正丁醇－冰醋酸－水－2%茚三酮乙醇溶液(3∶1∶1∶0.25)為展開劑,展開,取出,晾干,在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。結果見圖1。

圖1 蠐螬薄層色譜鑒別

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 肌苷對照品溶液制備 取肌苷對照品適量,精密稱定,加水制成50μg/mL的溶液,即得。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入水20 mL,稱定重量,超聲處理30 min,放冷,再稱定重量,用水補足減失重量,搖勻,置離心管中,離心(轉速為5 000轉/min)5 min,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇－水(5∶95)為流動相,檢測波長為260 nm。流速1.0 mL·min-1；檢測器：紫外(二極管陣列檢測器)；進樣量：10μL。對照品、供試品色譜見圖2、圖3。

圖2 對照品色譜

圖3 供試品色譜

2.3 方法學考查

2.3.1 線性關系 精密稱取肌苷對照品10.08 mg,置20mL量瓶中用水溶解并定容至刻度,作為對照品儲備液(504μg/mL)。精密吸取對照品儲備液0.05 mL、0.3 mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL分別置10 mL容量瓶中用水稀釋并定容至刻度,搖勻,即得(此溶液濃度分別為2.52μg/mL、15.12μg/mL、25.2μg/mL、50.4μg/mL、100.8μg/mL、252μg/mL)。分別取10μL注入液相色譜儀,按照上述色譜條件對樣品進行測定,以峰面積為縱坐標(Y),進樣濃度為橫坐標(X),峰面積對濃度作線性回歸方程。得回歸方程,Y＝15.127X＋2.096 5,R2＝0.999 9,表明肌苷在2.52～252μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 取肌苷對照品溶液濃度為50.4μg/mL,精密吸取對照品溶液10μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進樣6次,測定,即得。測定其峰面積,結果表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液(qc1),按照色譜條件測定,分別于配制后的0 h、3 h、9 h、12 h、15 h、20 h,精密吸取10μL,注入液相色譜儀,記錄峰面積,結果肌苷峰面積的RSD(n＝6)為0.9%,結果表明供試品溶液在20 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取樣品粉末6份(qc1),分別按照供試品制備供試品溶液。精密吸取10μL,注入液相色譜儀,記錄峰面積,計算肌苷含量,RSD為1.2%,實驗結果表明該方法重復性良好。

2.3.5 回收率試驗 取已知含量的供試品粉末6份(qc1),每份約0.5g,置20mL量瓶中,精密加入與其含有量相應對的照品溶液適量,加水定容至刻度,分別按照供試品制備方法制備供試品溶液,按色譜條件測定,記錄峰面積,計算回收率(n＝6),計算加標回收率,結果平均回收率為94.9%,RSD為1.3%,說明回收良好。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 (n＝6)

2.3.6 耐用性試驗 由于不同生產廠家不同牌號的色譜柱存在填料及性能上的差異,為考察擬訂方法的可行性及通用性,對3種品牌的色譜柱a：Sepax BR-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)、b：Waters HSS T 3(4.6 mm×250 mm,5μm)、c：InertsilODS-SP C18(4.6 mm×250mm,5μm)在3臺液相色譜儀(d：Agilent 1260型高效液相色譜儀、e：Thermo Ultimate 3000型液相色譜儀、f：島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀)上進行了比較。試驗得到的供試品色譜圖,主峰峰形對稱,主峰與雜質峰分離度良好,說明該方法具有較好的耐用性,理論塔板數(shù)暫定為不得低于3 000。結果見表2。

表2 耐用性試驗

2.3.7 樣品含量測定 按上述色譜條件測定10批供試品溶液,蠐螬中肌苷的百分含量見表3。

表3 樣品含量測定結果

通過10批次供試品肌苷測定結果,按干燥品計,平均含量為0.084 4%,按平均值的80%制定,限度定為0.060%。10批樣品含量測定中有2批不合格。

3 討論

3.1 薄層色譜

薄層鑒別傳統(tǒng)氨基酸展開劑均采用正丁醇∶冰醋酸∶水三相,調整不同比例進行展開,采用噴以茚三酮溶液。改良的展開劑為正丁醇－冰醋酸－水－2%茚三酮乙醇溶液(3∶1∶1∶0.25),加入顯色劑,避免噴顯色劑,斑點散開現(xiàn)象。提取溶劑考察采用乙醇、稀乙醇、水提取結果采用稀乙醇提取效果好。溫、濕度考察過程中,考慮由于實驗時的溫度、濕度會影響薄層色譜結果,我們采取高溫高濕和低溫低濕的實驗環(huán)境考察溫度和濕度對薄層色譜的影響,結果無明顯差別。

3.2 含量測定

考察采用水、20%甲醇、0.1%冰醋酸作為提取溶劑,考察振搖、超聲、回流提取方式,結果發(fā)現(xiàn)采用水提,超聲處理提取效果較好,操作方法簡單?？疾焯崛?0 min、20 min、30 min,結果發(fā)現(xiàn)超聲30 min提取效果好。但由于粉碎后蛋白質成分多,提取溶液不易濾過,而采用靜止過夜后才能濾過。為了減少分析測試時間,考察離心3 000 rpm·min-1、5 000 rpm·min-1、8 000 rpm·min-1、10 000 rpm·min-1、12 000 rpm·min-1,結果發(fā)現(xiàn)3 000rpm·min-1仍不易過濾,超過5 000 rpm·min-1后可以濾過。離心時間考察5 min、8 min、10 min,結果5 min離心就能夠達到較好的濾過效果,因此離心時間定為5 min。