不同菌種發(fā)酵制備蠶豆醬的研究

劉瑩，胡茂豐，劉素純，3*，王巨濤，吳章華

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；4.長沙市調(diào)料食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128）

不同菌種發(fā)酵制備蠶豆醬的研究

劉瑩1，胡茂豐2，劉素純1，3*，王巨濤4，吳章華4

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙410128；4.長沙市調(diào)料食品工程技術(shù)研究中心，湖南長沙410128）

本試驗研究米曲霉、黑曲霉、黑根霉、高大毛霉4種不同單一菌種分別發(fā)酵制得的蠶豆醬中蛋白酶、淀粉酶活力及主要成分、醬色OD420nm值等指標(biāo)在不同發(fā)酵時期的變化，并對發(fā)酵42 d的蠶豆醬進行感官評價。結(jié)果表明，米曲霉的中性及堿性蛋白酶活力較其他三種菌強，分別高達546.84 U和188.79 U。米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬氨基酸態(tài)氮含量最高，可達1.381 g/100 g，根霉、黑曲霉次之，毛霉最少。米曲霉和黑曲霉制得醬的顏色深，醬色OD420nm值高，另兩種霉制得醬的顏色較淺。米曲霉發(fā)酵制得蠶豆醬在色澤、氣味和口感上都達到一級標(biāo)準(zhǔn)，是制作蠶豆醬的良好發(fā)酵菌種。

霉菌；蠶豆醬；發(fā)酵；品質(zhì)

蠶豆醬是以去皮蠶豆為主要原料，經(jīng)發(fā)酵制成的半流動狀態(tài)的一類調(diào)味食品。我國生產(chǎn)蠶豆醬多采用自然發(fā)酵的方法，該方法的制曲過程是在開放式條件下進行，環(huán)境中的各種微生物混入后共同利用原料進行生長代謝，通過發(fā)酵、后熟等階段后形成了蠶豆醬特有的色香味。研究表明，霉菌是在發(fā)酵過程中起主要作用的一類微生物，從醬曲中分離所得到的霉菌經(jīng)鑒定主要有米曲霉、醬油曲霉、高大毛霉、黑曲霉等[1]。其中米曲霉菌種具有生長快、產(chǎn)孢量大，酶系豐富、不產(chǎn)毒素等特點[2]，因此目前生產(chǎn)蠶豆醬的制作工藝多使用該菌種作為發(fā)酵劑純種發(fā)酵制作蠶豆醬，但制作出來的產(chǎn)品與自然發(fā)酵生產(chǎn)的相比，風(fēng)味單一。近年來，針對此不足，很多研究學(xué)者都致力于利用米曲霉與其它菌種混合制曲發(fā)酵的工藝來提高蠶豆醬的質(zhì)量，而不同微生物因其代謝途徑的不同，會產(chǎn)生各類代謝物質(zhì)，再加上微生物的自溶物等，這些物質(zhì)相互作用，對于蠶豆醬的品質(zhì)會產(chǎn)生不同的影響。因此，本試驗擬以米曲霉、黑曲霉、高大毛霉、黑根霉四種不同單一菌種純種發(fā)酵制作蠶豆醬，分析發(fā)酵過程中醬醅的蛋白酶活力、淀粉酶活力及主要營養(yǎng)成分、成品感官評價等指標(biāo)的變化，旨在研究不同菌種對于蠶豆醬品質(zhì)形成的差異，對豐富蠶豆醬的風(fēng)味、提高蠶豆醬的質(zhì)量具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

麩皮：由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物教研室提供；去皮蠶豆及面粉：購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 菌種

黑根霉（Rhizopus nigricans）、高大毛霉（Mucor mucedo）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物教研室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種斜面活化培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

菌種擴大培養(yǎng)基：在300 mL的三角瓶加入干麩皮10 g，按麩皮∶水=1∶1～1∶1.2（g∶mL）比例加水調(diào)配均勻，在121℃條件下滅菌30 min，冷卻備用。

1.1.4 試劑

氫氧化鈉、甲醛、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、三氯乙酸、葡萄糖、10%鹽水等均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722s分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；TDL-40B型臺式離心機：上海嘉鵬科技有限公司；MJ-II-B系列霉菌培養(yǎng)箱：上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵劑的制備

菌種活化：在無菌條件下，將米曲霉、黑曲霉、毛霉、根霉分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，米曲霉、黑曲霉于30℃培養(yǎng)48 h，根霉于28℃培養(yǎng)60 h，毛霉于20℃培養(yǎng)60 h，備用。

麩曲制備：從試管斜面中取2～3環(huán)霉菌孢子接種到滅菌麩皮中，置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，米曲霉、黑曲霉于30℃培養(yǎng)48 h，根霉于28℃培養(yǎng)60 h，毛霉于20℃培養(yǎng)60 h，期間扣瓶一次，待其長滿孢子后，用牛皮紙包好整塊麩皮置于45～50℃的烘箱中烘干24 h，即可制得發(fā)酵劑。

1.3.2 蠶豆醬工藝流程

1.3.3 工藝要點

預(yù)處理：將挑選好的去皮蠶豆淘洗干凈，置于清水浸泡6 h左右，待其體積增加約一半后撈出。

滅菌：在121℃條件下滅菌5 min至蠶豆熟而不爛。

面粉處理：將面粉置于105℃干燥箱內(nèi)烘烤1.5～2.0 h。按蠶豆質(zhì)量的10%拌入面粉，攪拌均勻。

前期發(fā)酵：將蒸煮好的蠶豆，加入20%烘烤好的面粉拌合均勻，按照曲料（蠶豆+面粉）質(zhì)量的0.3%分別接入米曲霉、黑曲霉、根霉、毛霉的麩曲菌種于不同溫度培養(yǎng)，米曲霉、黑曲霉于30℃培養(yǎng)48 h，根霉于28℃培養(yǎng)60 h，毛霉于20℃培養(yǎng)60 h，制備曲坯。

加入食鹽以及后期保溫發(fā)酵：將由4種單一菌種分別制得的曲坯按坯∶鹽水=1∶1（m∶m）的比例添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽水，入壇后于40℃下保溫發(fā)酵。

1.3.4 理化指標(biāo)的測定

將發(fā)酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d的醬醅分別進行酶活力、氨基酸態(tài)氮、還原糖含量等主要指標(biāo)的測定。

蛋白酶活力測定：福林試劑法[3]；淀粉酶活力測定：DNS試劑法[4]；氨基酸態(tài)氮含量測定：電位滴定法[5]；還原糖含量的測定：直接滴定法[6]。

1.3.5 醬色的差異分析

分別取發(fā)酵3 d、12 d、22 d、32 d、42 d的醬醅樣品5 g，加入25 mL磷酸緩沖液勻漿，離心10 min，取上清液于波長420 nm處比色，以磷酸緩沖液為空白。

1.3.6 感官評價

感官評價參照劉素純的方法[7]，以12人組成品評組，鑒于40 d左右理化指標(biāo)等趨于穩(wěn)定，對4種發(fā)酵42 d醬醅的四項感官指標(biāo)進行分級檢驗，具體檢驗標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 蠶豆醬感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of broad bean paste

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單一菌種發(fā)酵蠶豆醬醅中蛋白酶活力的變化

分別對發(fā)酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d醬醅中的中性、酸性、堿性蛋白酶活力（以干基計）進行測定，試驗結(jié)果見圖1。

由圖1可知，蠶豆醬中蛋白酶活力的變化的趨勢基本為先增后減，由于各菌種在發(fā)酵前期的生長代謝旺盛，原料中蛋白質(zhì)有誘導(dǎo)作用[8]，使得霉菌的產(chǎn)酶能力不斷加強而酶活力增長較快。由圖1（A）可知，米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的能力很強，根霉、毛霉次之，在發(fā)酵2 d時米曲霉的中性蛋白酶活力高達546.84 U，遠遠超過其他3種霉菌。由圖1（B）可知，黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的能力較其他霉菌強，在發(fā)酵5 d后酸性蛋白酶活力仍有所增長。由圖1（C）可知，米曲霉產(chǎn)堿性蛋白酶的能力較強，毛霉和根霉次之，黑曲霉最弱。在后期階段，隨著食鹽水的加入和pH值的逐步減小，各蛋白酶活力都下降，原因之一是食鹽的加入抑制了霉菌的生長，使得各菌種產(chǎn)蛋白酶能力減小，原因之二是隨著發(fā)酵的進行，蛋白水解產(chǎn)物氨基酸、肽等抑制酶的形成，另外葡萄糖等易代謝的碳水化合物對蛋白酶的產(chǎn)生都有阻遏作用，因此會產(chǎn)生酶活力先增后減的趨勢[9]。

圖1 不同菌種發(fā)酵對蠶豆醬中性（A）、酸性（B）及堿性（C）蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of different moulds fermentation on neutral(A),acid(B) and alkaline(C)protease activity of broad bean paste

2.2 不同單一菌種發(fā)酵蠶豆醬醅中氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮的含量是反映蠶豆醬質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，其數(shù)值越高，表明菌種對蛋白質(zhì)的分解能力越強，成品的滋味越鮮美。國家頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定豆醬中氨基酸態(tài)氮的含量都不得＜0.6 g/100 g。本試驗中分別對發(fā)酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d醬醅中的氨基酸態(tài)氮含量進行測定，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 不同菌種發(fā)酵對蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of different moulds fermentation on amino acid nitrogen content of broad bean paste

由圖2可知，各菌種發(fā)酵的蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮含量在主發(fā)酵過程中是上升的，成品中含量都達到國家標(biāo)準(zhǔn)。在發(fā)酵前期階段，因為各菌種代謝旺盛，對氮源的需求量大，誘導(dǎo)菌種產(chǎn)蛋白酶能力不斷增強，對原料中的蛋白質(zhì)降解，游離氨基酸含量在發(fā)酵12～17 d中快速增加。由于米曲霉產(chǎn)中性和堿性蛋白酶能力較其它菌種強，由其發(fā)酵的蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮含量是增長最快且含量較多，根霉和黑曲霉次之，毛霉最少，這是因為毛霉分解蛋白質(zhì)的能力最弱，而黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶能力較強，且醬曲發(fā)酵后總酸增加，pH值降至4～5左右時使得后期發(fā)酵過程中黑曲霉也占有一定優(yōu)勢，對蛋白質(zhì)降解能力較毛霉強。在發(fā)酵后期，隨著食鹽水的加入和pH值的減小，菌種的生長代謝受到影響，酶活力被抑制，且食鹽溶液也會使得原料中一部分的蛋白質(zhì)溶出至發(fā)酵液中，從而使得蠶豆醬干基中的含氮物質(zhì)減少，因此氨基酸態(tài)氮含量的增長速度減緩，基本保持平衡。

2.3 不同單一菌種發(fā)酵蠶豆醬醅中淀粉酶活力的變化

分別對發(fā)酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d醬醅中的淀粉酶活力進行測定，實驗結(jié)果如圖3。

圖3 不同菌種發(fā)酵對蠶豆醬醅中淀粉酶活力的影響Fig.3 Effect of different moulds fermentation on amylase activity of broad bean paste

由圖3可知，各菌種淀粉酶活力呈現(xiàn)先增后減的趨勢，發(fā)酵前期增長速度較快，在發(fā)酵3～7 d左右基本達到最大值，不同菌種淀粉酶活力的變化表現(xiàn)為黑曲霉產(chǎn)淀粉酶能力最強，根霉和毛霉次之，米曲霉產(chǎn)淀粉酶能力較弱，最大值分別為78.47 U、62.33 U、49.34 U、42.13 U。這是因為發(fā)酵過程中醬醅的環(huán)境偏酸性，黑曲霉和根霉在酸性條件下產(chǎn)淀粉酶能力都較強[10-11]，因此黑曲霉和根霉能很好地進行生長代謝，有利于原料中碳水化合物的分解。后期淀粉酶活力的下降原因可能是因為食鹽的抑制、菌體生長代謝減弱以及蛋白酶、脂肪酶等酶的影響而抑制了淀粉酶的活力。

2.4 不同單一菌種發(fā)酵蠶豆醬醅中還原糖的變化

蠶豆醬的原料是蠶豆和面粉，其主要成分是蛋白質(zhì)、淀粉等，原料經(jīng)過高溫和高壓處理后，淀粉糊化被霉菌所產(chǎn)的淀粉酶降解，經(jīng)過一系列變化降解成還原糖等，這些糖類物質(zhì)對于蠶豆醬的品質(zhì)有著重要的影響。本實驗分別對發(fā)酵1 d、2 d、3 d、7 d、12 d、17 d、22 d、27 d、32 d、37 d、42 d醬醅中的還原糖含量進行測定，試驗結(jié)果如圖4。

圖4 不同菌種發(fā)酵對蠶豆醬中還原糖含量的影響Fig.4 Effect of different moulds fermentation on reducing sugar content of broad bean paste

由圖4可知，醬醅中還原糖含量在發(fā)酵12 d左右達到最大值后開始減少。由于四種霉菌中黑曲霉的淀粉酶活力最強，由其發(fā)酵的蠶豆醬中還原糖含量增長最多，其次是根霉，而米曲霉和毛霉依次排后。隨著發(fā)酵的進行，還原糖含量逐漸降低，分別由黑曲霉、根霉、毛霉、米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬在發(fā)酵42 d后還原糖含量依次降至10.82 g/100 g、10.29 g/100 g、8.25 g/100 g、7.35 g/100 g。還原糖含量下降一方面是由于后期發(fā)酵中糖類物質(zhì)被酵母菌和乳酸菌等其它微生物利用，另一方面是由于美拉德反應(yīng)要消耗還原糖[12]，同時隨著食鹽加入及總酸增加等因素的影響，霉菌的生長代謝減弱，抑制了其淀粉酶活力，導(dǎo)致醬醅中還原糖含量減小。

2.5 不同單一菌種發(fā)酵后蠶豆醬醬色的變化

隨著發(fā)酵的進行，醬醅中產(chǎn)生的黑色素會使醬的顏色逐漸變深，醬的顏色越深，則醬色OD420nm值越大。為比較不同菌種對蠶豆醬呈色的差異，本試驗分別取各菌種發(fā)酵3 d、12 d、22 d、32 d、42 d的蠶豆醬進行醬色OD420nm值的測定，結(jié)果如表2。

表2 不同菌種發(fā)酵對蠶豆醬醬色的的影響(OD420nm值)Table 2 Effect of different moulds fermentation on OD420nmvalue of broad bean paste

由表2可知，各菌種醬色OD420nm值在發(fā)酵前12 d變化較明顯，此時醬醅中黑色素的來源主要是醬曲中的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下氧化生成黑色素[13]，且發(fā)酵前期菌種多酚氧化酶活力較強。曲霉產(chǎn)酶能力較根霉和毛霉強，因此由黑曲霉和米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬顏色較深。隨著發(fā)酵時間延長，且保溫發(fā)酵的溫度達40℃，醬醅中多酚氧化酶活力減小，此時美拉德反應(yīng)是黑色素的主要來源[14]，所以醬色OD420nm值變化幅度減小。

2.6 不同單一菌種發(fā)酵蠶豆醬的感官評價

感官評價是對產(chǎn)品品質(zhì)最直觀的反映，因此本實驗對由這4種不同單一菌種分別發(fā)酵42 d的蠶豆醬醅進行感官評價，結(jié)果見表3。表3中數(shù)字表示認(rèn)為產(chǎn)品是該級別的人數(shù)。

表3 不同菌種發(fā)酵后蠶豆醬各項感官要素評價的統(tǒng)計Table 3 Statistical analysis of sensory evaluation data

對表3評價結(jié)果進行X2檢驗處理[15]，得出米曲霉發(fā)酵制得的蠶豆醬在色澤、氣味、口感方面都屬于一級，通過對產(chǎn)品色、香、味方面的分析比較，確定由米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬產(chǎn)品是較受歡迎的，米曲霉是制作蠶豆醬較理想的發(fā)酵菌種。

3 結(jié)論

通過比較四種不同單一菌種發(fā)酵的蠶豆醬在酶活力、成分及感官評價等指標(biāo)上的變化，得出米曲霉的中性及堿性蛋白酶活力較其他3種菌強，可分別高達546.84 U和188.79 U。黑曲霉的酸性蛋白酶及淀粉酶活力較強。米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮含量最高，達到1.381 g/100 g，還原糖含量從高到低的順序排列依次為黑曲霉、根霉、毛霉、米曲霉。對醬色OD420nm值的分析得出黑曲霉和米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬顏色最深，根霉和毛霉發(fā)酵的蠶豆醬顏色較淺，感官評價的結(jié)果表明米曲霉在色澤、氣味及口感上屬于一級。

綜合理化指標(biāo)及感官指標(biāo)考慮，米曲霉是制作蠶豆醬的良好發(fā)酵菌種，但是仍有一定的不足，在今后的實驗中，可以通過混菌發(fā)酵工藝可以彌補其產(chǎn)酸性蛋白酶及淀粉酶能力的不足，使產(chǎn)品中氨基酸態(tài)氮及還原糖等營養(yǎng)物質(zhì)的含量更高，達到豐富蠶豆醬風(fēng)味的目的。

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Preparation of broad bean paste fermented by different moulds

LIU Ying1,HU Maofeng2,LIU Suchun1,3*,WANG Jutao4,WU Zhanghua4
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China; 4.Research Center of Engineering and Technology for Seasoning Food,Changsha 410128,China)

The effect of Aspergillus oryzae,Aspergillus niger,Rhizopus nigricans and Mucor mucedo fermentation on protease activity,amylase activity,nutritional ingredients and OD420nmvalue of broad bean paste were determined,and sensory evaluation of the paste was conducted at the 42 d.The results showed that,neutral and alkaline protease activity of A.oryzae was stronger than the other three moulds,which were 546.84 U and 188.79 U, respectively.The amino acid nitrogen content fermented by each moulds in order was A.oryzae,R.nigricans,A.niger and M.mucedo,and the content in A.oryzae-fermented broad bean paste was 1.381 g/100 g.The pastes fermented by A.oryzae and A.niger were darker with higher OD420nmvalue,while the pastes fermented by the other two moulds were lighter with lower OD420nmvalue.The paste fermented by A.oryzae reached the first-level standard in color,flavor and taste,and it was the optimal mould in broad bean paste-making.

mould;broad bean paste;fermentation;quality

TS264.24

A

0254-5071（2014）10-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.014

2014-08-11

湖南省科技計劃項目（2012NK3072）

劉瑩（1991-），女，碩士研究生，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

*通訊作者：劉素純（1966-），女，博士，教授，研究方向為營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。