（揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

彎曲菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

朱佳琪，張小燕，黃金林，焦新安

（揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

根據(jù)彎曲菌16S rRNA基因的靶序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，對(duì)反應(yīng)條件和試劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，建立了快速檢測(cè)雞肉中彎曲菌的熒光定量PCR方法，并對(duì)其特異性、敏感性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。該方法除了對(duì)彎曲菌有擴(kuò)增曲線外，對(duì)其他常見(jiàn)食源性病原菌均未有擴(kuò)增曲線，具有較好的特異性；彎曲菌的最低檢測(cè)限為10 CFU/ mL；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，批內(nèi)可重復(fù)性變異系數(shù)在0.12%-2.1%之間，批間可重復(fù)性變異系數(shù)為1.7%。應(yīng)用該方法對(duì)68份雞肉樣品檢測(cè)彎曲菌陽(yáng)性率為95.6%（65/68），傳統(tǒng)分離方法陽(yáng)性率為89.5%（60/68），兩種方法的陽(yáng)性符合率為89.7%。本研究建立的熒光定量PCR方法靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)單，大大縮短檢測(cè)周期，可作為檢測(cè)雞肉樣品中彎曲菌的手段，為雞肉樣品彎曲菌的流行病學(xué)調(diào)查研究提供新的工具。

彎曲菌；16S rRNA基因；熒光定量PCR

彎曲菌是近年來(lái)日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視的一種人獸共患病原菌，可引起急性腹瀉和食物中毒，是導(dǎo)致成人和兒童腹瀉的重要病原菌，也是世界范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患致病菌[1-2]。在中國(guó)彎曲菌引起的腹瀉與沙門(mén)氏菌引起的腹瀉同樣常見(jiàn)，上海、北京等地多次報(bào)道因食用污染食物感染彎曲菌并引發(fā)疾病[3]。大量的流行病學(xué)研究表明，處理或消費(fèi)未煮熟雞肉是人感染彎曲菌病的主要途徑[4]，

減少或消除食物鏈尤其是禽類(lèi)食品中彎曲菌是控制該病的主要策略，因此建立靈敏準(zhǔn)確的彎曲菌檢測(cè)方法對(duì)預(yù)防和控制雞肉中彎曲菌具有重要作用。

傳統(tǒng)基于培養(yǎng)方法的彎曲菌檢測(cè)包括增菌、分離和鑒定，大概需要5-6天時(shí)間[5-6]。尤其是彎曲菌有可能處于活的不可培養(yǎng)（VBNC）狀態(tài)，這種狀態(tài)的細(xì)菌對(duì)人具有致病隱患但培養(yǎng)方法卻很難檢測(cè)出[7]。隨著基因組測(cè)序、在線數(shù)據(jù)庫(kù)和生物信息學(xué)分析的不斷完善，一些基于核酸的方法尤其是PCR方法已成為病原菌檢測(cè)的快速有效手段[8-9]。普通PCR存在著操作步驟繁瑣、容易造成污染、難以準(zhǔn)確定量檢測(cè)等不足，而熒光定量PCR方法是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，因重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、敏感性高和易操作等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)領(lǐng)域中一種重要的快速檢測(cè)手段[10]。

本研究針對(duì)彎曲菌的16S rRNA基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了一種快速檢測(cè)彎曲菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其重復(fù)性和特異性較好，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性及縮短檢測(cè)時(shí)間，為雞肉樣品中彎曲菌的流行病學(xué)調(diào)查研究及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供新手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 空腸彎曲菌（NCTC11168、ATCC33560）、結(jié)腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌等菌株由揚(yáng)州大學(xué)江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品（ABI PRISM 7500 Real-time PCR System）；Premix Ex TaqTM（ Perfect Real Time）（DRR039A）試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Gene-Bank公布的16S rRNA的基因序列（GenBank accession Y19244），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，其序列為：上游引物5’- GATTATCAAGTCTCTTGTGA -3’，下游引物5’- ATGGGTATTCTTGGTGATA -3’，熒光探針5’-（FAM）ACCACCAATTCCATCTGCCTCT（Eclipse）-3’，引物和探針均由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 模板DNA制備 采用熱煮沸法，吸取菌懸液1 mL以200 g離心5 min，重復(fù)3次，吸取上清，以9000 g離心3 min，重復(fù)3次，最后以蒸餾水懸浮，隔水煮沸20 min，取出立即置于冰上，9000 g離心5 min，所得上清液即為所述彎曲菌DNA樣品。

1.2.3 熒光定量PCR擴(kuò)增體系及條件優(yōu)化 分別對(duì)熒光定量PCR引物和探針濃度、模板濃度、退火溫度進(jìn)行篩選優(yōu)化。反應(yīng)體系為20μL，其中Premix Ex Taq（2× DRR039A）10μL，上下游引物各0.4μL，Probe 0.5μL，DNA模板2μL，50×ROX Reference DyeⅡ0.4μL，去離子水補(bǔ)至20μL。優(yōu)化后反應(yīng)條件為：95℃30 s；95℃5s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)；60℃測(cè)定熒光值。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)方法的特性評(píng)價(jià)

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將ATCC33560培養(yǎng)物懸于生理鹽水中，洗滌2遍，重新懸于1mL生理鹽水，充分混勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?×104-2×108CFU/mL 5個(gè)梯度的培養(yǎng)物；按1.4方法提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，并計(jì)算產(chǎn)生相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 特異性試驗(yàn) 將空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌等菌株制備成一定濃度的菌懸液，同時(shí)準(zhǔn)備經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)為陰性的樣品，用優(yōu)化的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估該方法的特異性

1.2.4.3 靈敏性試驗(yàn) 將ATCC33560彎曲菌培養(yǎng)物洗滌2遍，重新懸于1mL生理鹽水中，充分混勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?×100-1×106CFU/ mL 7個(gè)梯度的培養(yǎng)物；按1.2.2方法提取細(xì)菌基因組DNA，并用熒光定量 PCR方法檢測(cè)這7個(gè)稀釋度的彎曲菌DNA，確定其靈敏性。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)可重復(fù)性評(píng)價(jià)：將ATCC33560彎曲菌經(jīng)6次倍比稀釋?zhuān)總€(gè)濃度重

復(fù)2次，觀察Ct值之間的誤差；批間可重復(fù)性評(píng)價(jià)：將NCTC11168，ATCC33560兩株彎曲菌分別經(jīng)6次倍比稀釋?zhuān)總€(gè)濃度重復(fù)2次，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.2.4.5 熒光定量PCR方法與平板計(jì)數(shù)法的比較將ATCC33560培養(yǎng)物懸于生理鹽水中，洗滌2遍，重新懸于1mL生理鹽水中，充分混勻，并進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)玫?01-103CFU/mL 3個(gè)梯度培養(yǎng)物 ；用熒光定量 PCR方法檢測(cè)該 3個(gè)稀釋度的彎曲菌DNA，同時(shí)取100 μL菌懸液涂于無(wú)抗CCDA平板，42±1℃微需氧條件下培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5 雞肉樣品檢測(cè)

1.2.5.1 樣品采集 采集揚(yáng)州市某一活禽市場(chǎng)生鮮雞肉胴體樣品68份，采樣方法參考美國(guó)農(nóng)業(yè)部食品安全檢查署（ FSIS）HACCP法。使用含PBS的棉球均勻地擦拭禽肉內(nèi)外表面（先擦拭外表面250cm2，后擦拭內(nèi)表面250cm2，共計(jì)500cm2），將擦拭好的棉球置于采樣袋內(nèi)，并將樣品置于冰盒中，4h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5.2 樣品處理 擠出無(wú)菌棉球中的PBS置于指形管中，分別取100μL按1.2.2方法提取細(xì)菌基因組DNA備用，同時(shí)取100μL直接涂抹CCDA平板，42±1℃微需氧條件培養(yǎng)分離細(xì)菌。

1.2.5.3 熒光定量PCR方法檢測(cè) 將獲得的細(xì)菌基因組DNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

1.2.5.4 菌株分離純化和鑒定 將CCDA平板上的疑似菌落經(jīng)純化培養(yǎng)后制備菌落DNA模板，經(jīng)多重PCR方法（參照何蕊等[11]）和國(guó)標(biāo)方法（參照GB/T 4789.9-2008[12]）進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用彎曲菌16S rRNA基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得1條標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線的斜率為-3.286，截距為40.878（圖2），橫坐標(biāo)為細(xì)菌數(shù)量，縱坐標(biāo)為循環(huán)閾值Ct。從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出細(xì)菌數(shù)x與循環(huán)閾值Ct之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式為Ct=-3.286x+40.878，根據(jù)該表達(dá)式測(cè)算出所測(cè)樣中細(xì)菌數(shù)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，所建立的熒光定量PCR方法相關(guān)系數(shù)R2=0.999，表明該方法誤差較小，符合彎曲菌檢測(cè)要求。

圖1彎曲菌real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 特異性評(píng)價(jià)結(jié)果

如圖2所示，空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌均能特異性出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，而非彎曲菌的其他腸道細(xì)菌及陰性樣品均無(wú)反應(yīng)擴(kuò)增曲線，表明此方法的特異性較好。

圖2彎曲菌real-time PCR特異性擴(kuò)增曲線

2.3 靈敏性評(píng)價(jià)結(jié)果

稀釋至相應(yīng)濃度細(xì)菌量的基因組DNA分別取2μL進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果表明熒光定量PCR最低檢測(cè)限為10 CFU/mL（表1）。

表1彎曲菌探針熒光定量PCR靈敏性檢測(cè)

2.4 重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.1 批內(nèi)可重復(fù)性結(jié)果 將ATCC33560經(jīng)6次倍比稀釋?zhuān)恳粋€(gè)濃度重復(fù)2次，其熒光定量PCR結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示變異系數(shù)在0.12%-2.1%之間，說(shuō)明可重復(fù)性較好。

2.4.2 批間可重復(fù)性評(píng)價(jià) 分別將NCTC11168、ATCC33560兩株彎曲菌進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，

其檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，批間變異系數(shù)為1.7%，說(shuō)明可重復(fù)性較好。

表2熒光定量PCR批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

表3熒光定量PCR批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)方法與平板計(jì)數(shù)法的比較

圖3探針熒光定量PCR與平板計(jì)數(shù)方法的比較

2.6 雞肉樣品檢測(cè)結(jié)果

將揚(yáng)州某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的68份雞肉樣品分別用熒光定量PCR方法和平板計(jì)數(shù)方法進(jìn)行彎曲菌的檢測(cè)，結(jié)果顯示利用本研究建立的熒光定量PCR方法其檢測(cè)陽(yáng)性率為95.6%（65/68），傳統(tǒng)分離方法陽(yáng)性率為89.5%（60/68），靈敏性高于平板計(jì)數(shù)法，兩種方法的陽(yáng)性符合率為89.7%。

3 討論

在分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，熒光定量PCR技術(shù)以其敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)使得它在檢測(cè)病原菌中具有其他檢測(cè)方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性，已被用于各種來(lái)源病原體的診斷，包括人類(lèi)糞便[13-14]、食品、家禽、牛奶、水[15]以及環(huán)境樣品[16-17]等。彎曲菌作為一種重要的食源性病原菌已日益成為食品衛(wèi)生行業(yè)監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)，為了能了解食品中彎曲菌的污染狀況，很多學(xué)者已在這方面做了大量的工作，許多分子生物學(xué)手段也已經(jīng)被運(yùn)用于彎曲菌檢測(cè)中，但目前還沒(méi)有一個(gè)國(guó)際公認(rèn)的快速檢測(cè)彎曲菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。建立彎曲菌快速而特異的檢測(cè)方法，是有效控制和預(yù)防彎曲菌的關(guān)鍵所在。

本研究所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法能準(zhǔn)確檢測(cè)出雞肉樣品中彎曲菌的污染量，在101-108CFU/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其擴(kuò)增效率為0.999；該方法還具有高度特異性，其它相關(guān)的腸道食源性致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌、糞鏈球菌、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌經(jīng)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增后均無(wú)特異性擴(kuò)增曲線；彎曲菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)限為104CFU/mL，全過(guò)程至少需5-6天，而本方法僅需1小時(shí)，敏感度可檢測(cè)到10 CFU/mL；批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均很低，確保該方法隨著時(shí)間的推移其在定量上的可靠性和正確性。通過(guò)對(duì)雞肉樣品的檢測(cè)，熒光定量PCR方法與分離培養(yǎng)方法兩者的符合度為89.7%，熒光定量PCR法對(duì)樣品檢測(cè)的靈敏度大于分離培養(yǎng)，造成這種差別的原因可能是樣品中彎曲菌處于VBNC狀態(tài)或者樣品中有活力的彎曲菌數(shù)太少以至于培養(yǎng)方法不能分離得到，而熒光定量PCR對(duì)于處于這種狀態(tài)的彎曲菌同樣具有檢測(cè)的能力，可以有效地反映出樣品中彎曲菌的攜帶情況。

綜上所述，本研究建立的彎曲菌熒光定量PCR檢測(cè)方法具有足夠的靈敏度與準(zhǔn)確性，適用于雞肉樣品中彎曲菌的快速檢測(cè)，為雞肉樣品中彎曲菌危害因子的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了新的手段。

[1] Altekruse S F，Stern N J，F(xiàn)ields P I，et al. Campylobacter jejuni--an emerging foodborne pathogen[J]. Emerg Infect Dis，1999，5（1）：28-35.

[2] Moore J E，Corcoran D，Dooley J S，et al. Campylobacter[J]. Vet Res，2005，36（3）：351-382.

[3] 吳蜀豫，張立實(shí)，冉陸. 彎曲菌及彎曲菌病的流行現(xiàn)狀[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2004，（1）：58-61.

[4] Mandell G L，Bennett J E，Dolin R. Principles and practice of

infectious diseases[M]. 4th ed，New York：Churchill Livingstone，1995.

[5] ISO10272-1：2006. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs--Horizontal Method for Detection and Enumeration of Campylobacter spp. Part 1：Detection Method[S].

[6] Fitzgerald C，Whichard J，Nachamkin I. Diagnosis and antimicrobial susceptibility of Campylobacter species，Campylobacter[M]. Washington DC：ASM Press，2008.

[7] Rollins D M，Colwell R R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment[J]. Appl Environ Microbiol，1986，52：531-538.

[8] Josefsen M H，Lofstrom C，Hansen T B，et al. Rapid quantifcation of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses，using real-time PCR and propidium monoazide treatment，as a tool for quantitative risk assessment[J]. Appl Environ Microbiol，2010，76：5097-5104.

[9] Liu J，Gratz J，Maro A，et al. Simultaneous detection of six diarrhea-causing bacterial pathogens with an in-house PCR-luminex assay[J]. J Clin Microbiol，2012，50：98-103.

[10] Mackay I M，Arden K E，Nitsche A. Real-time PCR in Virology[J]. Nucleic Acids Res，2002，30（6）：1292-1305.

[11] 何蕊，黃金林，許海燕，等. 彎曲菌多重PCR檢測(cè)方法的建立及其初步應(yīng)用[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2007， 28（1）：5-7.

[12] 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[S]. 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)-空腸彎曲菌檢驗(yàn). GB/T 4789.9-2008：59-66.

[13] Lagier M J，Joseph L A，Passaretti T V，et al. A real-time multiplexed PCR assay for rapid detection and differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli[J]. Mol Cell Probes，2004，18（4）：275-282.

[14] Lin S，Wang X，Zheng H，et al. Direct detection of Campylobacter jejuni in human stool samples by real-time PCR[J]. Can J Microbiol，2008，54（9）：742-747.

[15] Yang C，Jiang Y，Huang K，et al. Application of real-time PCR for quantitative detection of Campylobacter jejuni in poultry，milk and environmental water[J]. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003，38（3）：265-271.

[16] Chaban B，Ngeleka M，Hill J E. Detection and quantification of 14 Campylobacter species in pet dogs reveals an increase in species richness in feces of diarrheic animals[J]. BMC Microbiol，2010，10：73.

[17] Rothrockm J，Cook K L，Bolster C H. Comparative quantification of Campylobacter jejuni from environmental samples using traditional and molecular biological techniques[J]. Can J Microbiol，2009，55（6）：633-641.

Development and Application of Real-time PCR Assay for Quantitative Detection of Campylobacter spp

Zhu Jiaqi，Zhang Xiaoyan，Huang Jinlin，Jiao Xinan

（1. Jiangsu Key Lab of Zoonosis/Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

To establish a rapid assay for quantitative detection of Campylobacter spp.，a pair of primers and fuorescent probe were designed according to 16S rRNA sequence of Campylobacter spp.，and then a real-time PCR method was successfully established to detect Campylobacter spp. Results demonstrated that the method was specifc for amplifcation of Campylobacter spp.，but no amplifcation for other related bacteria. The detection limit of the assay was 10CFU/mL and the correlation coeffcient of standard curve（R2）was 0.999. The detection of 68 chicken meat samples showed that the positive rate was 95.6%，while the positive rate was 89.5% by traditional culture method. The method was simple，rapid，specifc and sensitive for rapid detection of Campylobacter spp. and a new tool for epidemiological investigation of Campylobacter spp. in chicken meats.

Campylobacter spp.；16S rRNA gene；real-time PCR

S8562.613；TS207.4

：A

：1005-944X（2014）12-0070-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（31372449）、國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BAD13B02）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)校建設(shè)工程項(xiàng)目、江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXLX13-922）資助

黃金林