脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞的實驗研究

周霞

貴州省人民醫(yī)院急診科，貴州貴陽550000

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞的實驗研究

周霞

貴州省人民醫(yī)院急診科，貴州貴陽550000

目的運用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞（HSC-T6），比較不同質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例及不同時刻轉(zhuǎn)染HSC后綠色熒光蛋白的表達，確定高表達陽性克隆G418篩選條件。方法將細胞按質(zhì)粒與脂質(zhì)體的不同比例分為四組：A組（2ug：3uL），B組（2ug：4uL），C組（2ug：5uL），D組（2ug：6uL）混合后轉(zhuǎn)染大鼠HSC，約24 h觀察轉(zhuǎn)染率，以最高轉(zhuǎn)染率的質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，轉(zhuǎn)染大鼠HSC，比較轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的轉(zhuǎn)染率；用不同濃度G418進行篩選，確定篩選最佳濃度，通過G418篩選建立高表達EGFP的HSC-T6陽性克隆。結(jié)果轉(zhuǎn)染24 h后，各組均有綠色熒光蛋白的表達，與A、B、D組比較，C組轉(zhuǎn)染率明顯增高（P＜0.05），質(zhì)粒與脂質(zhì)體以2ug：5uL轉(zhuǎn)染HSC后，隨時間延長，轉(zhuǎn)染后48 h轉(zhuǎn)染率最高（P＜0.05），72 h有所下降，G418篩選最佳濃度為400 ug/mL，經(jīng)篩選約21d后可陽性克隆，更換為正常培養(yǎng)液可繼續(xù)培養(yǎng)和傳代。結(jié)論Lipofectamine 2000可有效轉(zhuǎn)染HSC，經(jīng)G418篩選形成陽性克隆，為基因治療肝纖維化的研究提供依據(jù)。

脂質(zhì)體；大鼠；肝星狀細胞

重組質(zhì)粒作為研究基因功能的主要手段，目前正得到越來越廣泛的應(yīng)用。運用基因轉(zhuǎn)染載體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，并可建立穩(wěn)定表達目的基因的細胞株。脂質(zhì)體作為非病毒轉(zhuǎn)染載體，其介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染是通過脂質(zhì)體DNA復(fù)合物與細胞融合，將DNA導(dǎo)入細胞，具有高效、簡便、對細胞損傷小和容易重復(fù)等優(yōu)點。本實驗自2013年10月—2014年5月運用陽離子脂質(zhì)體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC-T6，并篩選轉(zhuǎn)染陽性克隆，初步探索Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HSC-T6的條件及方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

大鼠肝星狀細胞株HSC-T6、pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒由武漢協(xié)和醫(yī)院胃腸病實驗室提供。感受態(tài)大腸桿菌DH-5ɑ購自武漢晶賽生物工程技術(shù)公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒購自寧波中鼎公司，G418購自北京索萊寶生物科技有限公司，陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5ɑ，擴大培養(yǎng)后，采用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用紫外分光光度計測定濃度，調(diào)整質(zhì)粒濃度為1ug/ul，過濾滅菌備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞株HSC-T6在含15%胎牛血清（FCS）的DMEM液，置于37℃，體積分數(shù)為5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，將HSC-T6細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105個細胞，過夜培養(yǎng)后，按質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例分為四組：A組（2ug：3ul），B組（2ug：4uL），C組（2ug：5uL），D組（2ug：6uL）。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染取一試管加入pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒，用250uL Opti-MEM培養(yǎng)基混合稀釋，另取試管分別加入3uL，4uL，5uL及6uL Lipofectamine 2000，用250uL Opti-MEM培養(yǎng)基混合稀釋，室溫?zé)o菌條件下放置5 min，將質(zhì)粒分別與不同劑量Lipofectamine 2000混合后放置20 min，每孔加入量為500 uL混合液培養(yǎng)4 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后記數(shù)10個200倍視野下發(fā)綠色熒光的細胞及同視野光鏡下細胞數(shù)計算轉(zhuǎn)染率，確定質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的最佳比例，按質(zhì)粒與脂質(zhì)體最佳比例轉(zhuǎn)染HSC-T6，觀察轉(zhuǎn)染24、48、76 h轉(zhuǎn)染率，各組細胞設(shè)置三個復(fù)孔。

1.2.4 G418篩選將HSC-T6接種于24孔板中，每孔2×105個細胞，培養(yǎng)過夜后，分別加入含100、150、200、250、300、350、400、500、700ug/mL，800ug/lG418培養(yǎng)基，15%FCS的DMEM培養(yǎng)液2ml，觀察15 d后細胞全部死亡的G418最低濃度，實驗均重復(fù)三次。

1.2.5 G418篩選陽性克隆將HSC-T6細胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105個細胞，過夜培養(yǎng)后，按細胞轉(zhuǎn)染方法，將pcDNA3.1 (+)-EGFP與Lipofectamine 2000按最佳比例轉(zhuǎn)染HSC，4h后改用含G418培養(yǎng)基進行篩選，篩選出陽性克隆后，更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)和傳代。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

記量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理，數(shù)據(jù)顯著性檢驗用方差分析，并進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染率的觀察

將pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamine 2000以2ug：3uL，2ug：4uL，2ug：5uL及2ug：6uL轉(zhuǎn)染HSC-T6，24 h后均可見綠色熒光蛋白的表達，與A、B、D各組比較，C組轉(zhuǎn)染率明顯增高（P＜0.05見表1）。

表1 各組轉(zhuǎn)染率比較

2.2 不同時間點轉(zhuǎn)染率的觀察

將pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamine 2000以2ug：5uL轉(zhuǎn)染HSC-T6后，24 h即可見綠色熒光蛋白表達，48h綠色熒光蛋白表達最高，72 h則有所下降，48 h時轉(zhuǎn)染率較24 h明顯增高（29.22± 1.14 vs 19.47±4.16 P＜0.05），與72 h比較無明顯差異（29.22±1.14 vs 24.66±2.00 t=7.764，P=0.088）。

2.3 脂質(zhì)體Lipofectamin 2000對細胞的毒性作用和G418篩選

應(yīng)用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HSC-T6后鏡下觀察顯示，在5uL的用量下，HSC-T6細胞未見明顯細胞死亡表現(xiàn)。篩選結(jié)果顯示：當(dāng)細胞更換為含G418的培養(yǎng)基后，隨G418濃度升高，時間延長，各孔均可見細胞死亡，6 d后，500ug/mL濃度以上細胞全部死亡，篩選15 d后，細胞全部死亡最低濃度為300ug/mL。

2.4 陽性克隆的篩選

pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamine 2000比例為2u：5uL轉(zhuǎn)染HSC-T6 4 h，改用含400ug/mlG418培養(yǎng)基，15%FCS的DMEM培養(yǎng)液2 mL，6 d后細胞大部分死亡，G418濃度減至200ug/mL維持篩選，殘存細胞約14d后形成陽性克隆（圖1）。

圖1 篩選20 d后陽性

3 討論

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用都已取得了很大的進展。目前使用的基因傳遞載體有病毒載體和非病毒載體兩類[1]。陽離子脂質(zhì)體作為非病毒載體，在基因轉(zhuǎn)染中得到廣泛應(yīng)用[2-3]。HSC作為肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)倍受關(guān)注，以HSC為靶標(biāo)的治療措施逐漸成為抗纖維化的重要方法[4]。較多實驗通過基因轉(zhuǎn)染的方法，體外研究HSC激活機制或抗纖維化機制的研究，但其轉(zhuǎn)染條件及方法仍需進一步研究。本實驗運用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pcDNA3.1(+)-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC，24 h后可見綠色熒光蛋白表達情況，說明Lipofectamine 2000可成功轉(zhuǎn)染HSC-T6。

國外研究已證實，脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染率除外與陽離子脂質(zhì)體的構(gòu)型有關(guān)外，還與陽離子脂質(zhì)體與DNA的比例，脂質(zhì)體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體復(fù)合物的劑量等有關(guān)[5-6]。脂質(zhì)體/DNA復(fù)合體的大小和形狀受陽離子脂質(zhì)體和DNA的摩爾比影響，脂質(zhì)體與DNA的電荷比在1∶1時，則有明顯的大小及結(jié)構(gòu)的改變，形成的復(fù)合體的粒徑最大，在體內(nèi)的半衰期延長，基因轉(zhuǎn)染效率最高[7-8]。我們將質(zhì)粒與不同劑量脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染HSC-T6，當(dāng)質(zhì)粒與Lipofectamine 2000比例為2ug：5uL時，轉(zhuǎn)染率最高，同時，觀察轉(zhuǎn)染24、48及72 h后綠色熒光蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)隨著時間延長，轉(zhuǎn)染率有所增高，48 h轉(zhuǎn)染率最高，72 h后綠色熒光蛋白的表達有所下降?；诒狙芯?，推測質(zhì)粒與Lipofectamine 2000比例為2ug：5uL時，脂質(zhì)體與DNA電荷比接近1：1，可獲得最佳轉(zhuǎn)染率，但隨著時間的延長至72 h，綠色熒光蛋白的表達會有所下降，目的基因不能得到穩(wěn)定的表達。

為了目的基因得到穩(wěn)定表達，可根據(jù)質(zhì)粒上帶有的耐藥基因而選擇相應(yīng)藥物進行篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，目前最常用的方法是G418篩選。HSC-T6細胞系經(jīng)G418篩選15 d后，細胞全部死亡最低濃度為300ug/mL，確定篩選濃度為400ug/mL，維持篩選濃度為200ug/mL。將pcDNA3.1(+)-EGFP與Lipofectamin 2000比例為2u：5uL轉(zhuǎn)染HSC-T6 4 h后，通過G418篩選，約20 d后可形成陽性克隆，并可正常培養(yǎng)和傳代。

本研究證實：Lipofectamine 2000可高效轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞系HSC-T6，當(dāng)質(zhì)粒與脂質(zhì)體比例為2ug：5uL可獲得最高轉(zhuǎn)染率，G418篩選可獲得基因穩(wěn)定表達的細胞克隆，本實驗為運用該細胞系進行基因轉(zhuǎn)染方面的研究，尤其是運用穩(wěn)定表達目的基因的細胞系開展肝臟疾病，特別是肝纖維化方面的研究奠定基礎(chǔ)。

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R78

A

1672-5654（2014）10（c）-0180-02

2014-08-13）

周霞（1982-），女，漢族，貴州遵義人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)科臨床工作。