產(chǎn)酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶活性研究

張居作，李志波，徐君飛*

（1.懷化學(xué)院生命科學(xué)系民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

產(chǎn)酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶活性研究

張居作1，2，李志波1，徐君飛1*

（1.懷化學(xué)院生命科學(xué)系民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南懷化418008；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

采用酸性魔芋精粉平板，從土壤中分離到兩株產(chǎn)酸性甘露聚糖酶菌株，命名為L(zhǎng)Z11、LZ12；分別對(duì)菌株LZ11、LZ12在生長(zhǎng)過程中分泌酸性甘露聚糖酶的活力進(jìn)行跟蹤研究后發(fā)現(xiàn)，這兩株菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期皆為2～12 h，發(fā)酵8 h后，酶活力呈明顯上升趨勢(shì)，14 h達(dá)到峰值，分別為23.15 U，19.09 U；選擇酶活力稍高的菌株LZ11進(jìn)行鑒定，根據(jù)生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

甘露聚糖酶；篩選；鑒定；酶活性

甘露聚糖是以β-1,4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結(jié)而成的線狀多糖，是構(gòu)成植物半纖維素的必要成分之一[1]。β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannase，EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-D-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，廣泛應(yīng)用在保健食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)[2-3]。

微生物β-甘露聚糖酶的研究主要集中在產(chǎn)堿性和中性甘露聚糖酶菌種的篩選、誘變，酶的誘導(dǎo)、提純，酶水解底物方式，酶基因克隆表達(dá)等方面[4]，而作為保健食品開發(fā)的甘露聚糖酶制劑需要符合人體胃腸道的環(huán)境條件，因此酸性β-甘露聚糖酶制劑的開發(fā)具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。本研究采用酸性魔芋粉平板，從土壤中篩選出大量產(chǎn)酸性β-甘露聚糖酶菌株，通過比較，得到較具優(yōu)勢(shì)的兩株菌株LZ11、LZ12，對(duì)其產(chǎn)酶活性進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

魔芋粉、蛋白胨、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：上海化學(xué)試劑公司。

1.1.2 培養(yǎng)基（按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)）

（1）篩選培養(yǎng)基：魔芋粉0.8%，瓊脂粉2.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl0.5%，臺(tái)盼藍(lán)0.05%，pH5.0，121℃滅菌20 min。

（2）種子培養(yǎng)基[5]：魔芋粉0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，NaCl 0.5%，pH 5.0，121℃滅菌20 min。

（4）菌種保存培養(yǎng)基：瓊脂粉2.0%，蛋白胨0.5%，牛肉膏或酵母膏0.5%，NaCl 0.5，自然pH，121℃滅菌20 min。

（5）甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0，每管分裝4～5 mL，121℃滅菌20 min。

（6）營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%，明膠10.0%，pH 7.2，分裝試管，培養(yǎng)基高度約4.5 cm，121℃滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料的處理

稱取土壤4.0 g，加入裝有40 mL無菌水的三角瓶中，振蕩30 min，作為備用實(shí)驗(yàn)菌液。

1.3.2 β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

將備用實(shí)驗(yàn)菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別涂布于篩選培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)48 h，尋找在平板上生長(zhǎng)良好且有明顯水解圈的菌株作為初篩所得菌株。分別將初篩得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h后，按2%的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，各吸取10 μL點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察各菌株在篩選培養(yǎng)基上的水解圈情況并進(jìn)行測(cè)量，挑選水解圈直徑與菌落直徑比值較大的菌落進(jìn)行連續(xù)分純與繼代培養(yǎng)，斜面保藏，備用。

1.3.3 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[5-6]

取六支具塞比色試管，按表1分別加入1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)甘露糖溶液、蒸餾水和DNS試劑，于沸水浴準(zhǔn)確反應(yīng)2 min，取出，用流水迅速冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，以0管作空白對(duì)照，測(cè)定各管的OD540nm值。以甘露糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，OD540nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

表1 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Table 1 Standard curve drawing of mannose

1.3.4 LZ11、LZ12生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將復(fù)篩得到的優(yōu)勢(shì)菌株LZ11、LZ12接種于種子培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h后，按2%的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，從0 h開始測(cè)定其OD660nm，一直到平緩期，繪制菌株LZ11、LZ12的生長(zhǎng)曲線。設(shè)置三個(gè)平行。

1.3.5 LZ11、LZ12分泌酸性β-甘露聚糖酶活力變化曲線測(cè)定

（1）粗酶液的制備[7-8]

將LZ11、LZ12接種于種子培養(yǎng)基，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)8h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)，從0 h開始，每隔2 h從發(fā)酵培養(yǎng)基中吸取10 mL發(fā)酵液，4000r/min、4℃離心10min，取上清液作為粗酶液。

（2）酸性β-甘露聚糖酶活力測(cè)定及酶活力變化曲線的繪制[9-10]

取2.0 mL預(yù)熱至50℃，以pH 5.8，0.05 mol/L檸檬酸-0.05 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液配制的2.0 g/L魔芋膠底物，添加1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，50℃下準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，同時(shí)取1mL酶液于另一管中煮沸滅活處理，冷卻后加入2 mL底物，作為對(duì)照。反應(yīng)完成后分別向各管加入2 mL DNS終止反應(yīng)，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法，測(cè)OD540nm，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的甘露糖的含量，計(jì)算得出β-甘露聚糖酶活力，繪制酶活力變化曲線。設(shè)置三個(gè)平行。

酶活力單位定義為：以2%魔芋膠為底物，每小時(shí)釋放1 mg相當(dāng)于D-甘露糖的還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.6 菌株LZ11的鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察

將菌株LZ11接種于種子培養(yǎng)基，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10-3稀釋度的菌液在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，做2個(gè)平行；10-4、10-5和10-6三個(gè)稀釋度的菌懸液分別涂布于篩選培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平行，30℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌株在篩選平板上的菌落形態(tài)。

（2）芽胞的檢測(cè)[11]

用孔雀綠染色法檢測(cè)細(xì)菌是否產(chǎn)生芽胞。

（3）生理生化實(shí)驗(yàn)[11]

接觸酶實(shí)驗(yàn)，耐鹽性實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，利用葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)，明膠液化實(shí)驗(yàn)，淀粉水解實(shí)驗(yàn)，甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、耐熱性實(shí)驗(yàn)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的篩選

將菌懸液涂布于篩選培養(yǎng)基，能分解魔芋粉產(chǎn)生水解圈的菌株較多，分離能產(chǎn)生水解圈的菌株活化液，點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，形成的菌落及水解圈情況如圖1所示。

圖1 篩選培養(yǎng)基上的菌落和水解圈Fig.1 Colonies and hydrolysis circle on the screening medium

由圖1可以看出，經(jīng)初篩后的菌株活化液在篩選培養(yǎng)基上形成明顯的水解圈，經(jīng)多次純化后，反復(fù)比較各菌落直徑大小和水解圈直徑大小，選擇2株菌落形態(tài)有明顯區(qū)別，且水解圈與菌落直徑之比較大的菌株1、2作為初篩所得菌株，命名為L(zhǎng)Z11、LZ12。

將LZ11、LZ12同時(shí)點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)48 h后，測(cè)量LZ11菌落直徑的平均值為0.35 cm，水解圈直徑的平均值為1.60cm，計(jì)算得水解圈直徑/菌落直徑=4.57；LZ12菌落直徑的平均值為0.40 cm，水解圈直徑的平均值為1.36 cm，計(jì)算得水解圈直徑/菌落直徑=3.40。結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，LZ11分泌甘露聚糖酶的能力可能比菌株LZ12高。

2.2 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得不同濃度甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在540 nm波長(zhǎng)下的OD540nm值，以甘露糖的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的OD540nm值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of mannose

由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.571 6x-0.006 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3，表明二者相關(guān)性較好。

2.3 LZ11、LZ12的生長(zhǎng)曲線

每隔2 h測(cè)定LZ11、LZ12發(fā)酵液在660 nm波長(zhǎng)下的光密度值，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD660nm為縱坐標(biāo)，繪制LZ11、LZ12的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

圖3 LZ11、LZ12的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain LZ11 and LZ12

由圖3可知，在30℃發(fā)酵條件下，菌株LZ11、LZ12都在發(fā)酵2 h開始呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，而在13 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。這為對(duì)該菌的進(jìn)一步研究提供了指導(dǎo)，可以選擇以對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期的發(fā)酵液作為β-甘露聚糖酶活力測(cè)定的目標(biāo)物。

2.4 LZ11、LZ12的活力變化曲線

隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株LZ11、LZ12的發(fā)酵液中分泌的酸性β-甘露聚糖酶活力結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌株LZ11、LZ12分泌的β-甘露聚糖酶活力變化曲線Fig.4 Change curve of β-mannase activity secreted by strain LZ11 and LZ12

由圖4可知，菌株LZ11、LZ12在發(fā)酵8 h時(shí)達(dá)到酶活高峰，分別為23.15 U、19.09 U。相對(duì)于許多報(bào)道中有關(guān)β-甘露聚糖酶酶活大小，其值顯得相對(duì)偏小，這可能與實(shí)驗(yàn)限定的酸性等條件有關(guān)。隨后緩慢下降，這可能是因?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，甘露聚糖酶出現(xiàn)了自溶的現(xiàn)象，導(dǎo)致酶活力下降。對(duì)活力稍高菌株LZ11進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.5 LZ11菌種鑒定

2.5.1 菌落形態(tài)觀察

菌株LZ11在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)如圖5所示。

圖5 LZ11菌落形態(tài)Fig.5 Colonial morphology of LZ11

由圖5可知，LZ11的菌落形態(tài)為圓形，表面干燥，菌落周圍不整齊中間形成皺起，無光澤，灰白色，不透明。

2.5.2 LZ11芽孢的檢測(cè)

對(duì)菌株LZ11進(jìn)行革蘭氏染色和孔雀綠芽胞染色，觀察LZ11的染色結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，LZ11為革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽胞，參考細(xì)菌鑒定手冊(cè)[11]，該菌可以按照產(chǎn)芽孢細(xì)菌的鑒定方法進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)。

圖6 LZ11革蘭氏染色和芽胞染色結(jié)果Fig.6 Gram stain and spore stain results of strain LZ11

2.5.3 生理生化實(shí)驗(yàn)

LZ11生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiology and biochemistry experiment

綜合表2結(jié)果，參考細(xì)菌鑒定手冊(cè)，可初步判斷LZ11屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇從土壤中篩選出能夠在酸性條件下分解甘露聚糖的微生物，并進(jìn)行對(duì)其鑒定研究，以期能夠獲得在酸性環(huán)境中用于實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用的菌種。采用特異底物水解圈篩選，獲得兩種能夠在pH為5～6條件下水解魔芋膠的菌種，通過初步鑒定，其中一株酶活力較大的菌種屬于芽胞桿菌屬（Bacillussp.）。再對(duì)其酶活的測(cè)定后發(fā)現(xiàn)其酶活分別為23.15 U，19.09 U；與其他研究報(bào)道存在較大差距。但本實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)菌種發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，即不是在菌種發(fā)酵的最佳條件下進(jìn)行其酶活測(cè)定，同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究的是酸性β-甘露聚糖酶，不同于細(xì)菌比較適宜的中性或堿性環(huán)境，這可能是導(dǎo)致差距存在的兩個(gè)主要原因。另外，所選取的材料以及測(cè)酶活時(shí)底物的不同也可能是造成差距存在的重要因素。

當(dāng)今世界能源日漸短缺，加上半纖維素分解后產(chǎn)生的低分子物質(zhì)具有許多生理功能，國(guó)內(nèi)外對(duì)半纖維素的開發(fā)利用十分熱門[12-14]，但是，在努力提高半纖維素酶生產(chǎn)量的同時(shí)，怎樣將實(shí)驗(yàn)室的研究成果更好地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際效益，還有待進(jìn)一步深入研究。

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Screening and identification of acidic mannase-producing strain and its enzymatic activity

ZHANG Juzuo1，2,LI Zhibo1,XU Junfei1*
(1.Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources,Department of Life Science, Huaihua University,Huaihua 418008,China;2.Faculty of Veterinary,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)

Two acidic mannase-producing strains were isolated from soil by acidic konjac powder plate,and were named LZ11 and LZ12.The mannase activities secreted by strain LZ11 and LZ12 were tracked and their growth curve showed that the logarithmic phase was both at 2-12 h.After 8 h fermentation,the enzyme activity obviously increased,and the peak was at the 14 h.At that time,the enzyme activities of strain LZ11 and LZ12 were 23.15 U and 19.09 U,respectively.The strain LZ11 with higher enzyme activity was selected and identified asBacillussp.according to the physiological and biochemical test results.

mannase;screening;identification;enzymatic activity

S154.3

A

0254-5071（2014）11-0063-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.014

2014-09-02

湖南省科技廳項(xiàng)目（2013NK4109）；湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助（2011-42）；民族藥用植物活性成分高效利用湖南省高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)經(jīng)費(fèi)資助（2010-53）

張居作（1981-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樯飳W(xué)。

*通訊作者：徐君飛（1981-），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。