水貂源肺炎雷伯菌的分離鑒定及致病性測(cè)定

（山東省鄒平縣畜牧獸醫(yī)局，山東鄒平 256200）

水貂源肺炎雷伯菌的分離鑒定及致病性測(cè)定

王 劍，韓耀東，楊 廣

（山東省鄒平縣畜牧獸醫(yī)局，山東鄒平 256200）

[目的]為鑒定引發(fā)某養(yǎng)殖場(chǎng)水貂死亡的主要致病菌。[方法]從送檢病貂獲取的兩株優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特征觀察、生化試驗(yàn)、細(xì)菌16S-23S rRNA ISR基因的PCR鑒定、藥物敏感試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)。[結(jié)果]16S-23S rRNA ISR基因的PCR序列分析顯示兩分離株與已知的Kpn相應(yīng)序列的同源性為99.9%。藥物敏感試驗(yàn)表明分離菌株對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、頭孢他啶高度敏感。致病性試驗(yàn)表明兩菌株對(duì)小鼠均有較強(qiáng)的致病性，半數(shù)致死量分別為4.9×106cfu/mL、3.1×106cfu/mL。[結(jié)論]確診分離到的兩株優(yōu)勢(shì)菌是肺炎克雷伯菌，且該菌是導(dǎo)致水貂死亡的主要致病菌。

水貂；肺炎克雷伯菌；分離鑒定；致病性

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）屬于腸桿菌科、克雷伯菌屬，被列為條件致病菌，是目前公認(rèn)的導(dǎo)致動(dòng)物和人類(lèi)發(fā)病的克雷伯氏菌[1-2]，可引起支氣管炎、肺炎、泌尿系統(tǒng)和創(chuàng)傷感染、敗血癥、腦膜炎、腹膜炎等[3]。現(xiàn)已從禽類(lèi)[4]、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)[5]、水貂[6]等多種動(dòng)物體內(nèi)分離到這種細(xì)菌，因此，該菌作為人畜共患病病原應(yīng)當(dāng)引起重視。

我國(guó)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，水貂在山東地區(qū)的養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度的不斷提高導(dǎo)致各種疾病頻發(fā)，條件致病菌越來(lái)越成為水貂細(xì)菌病的主要病原[8-9]。肺炎克雷伯的感染率日益升高，已經(jīng)成為僅次于大腸桿菌的重要條件致病菌[10]。且隨著抗生素的濫用，其耐藥性逐漸增強(qiáng)，增加了臨床治療難度。

對(duì)2013年8—9月份山東諸城市水貂養(yǎng)殖戶送檢的頸部膿腫及肺部出血死亡的病貂，進(jìn)行細(xì)菌分離并獲得了兩株優(yōu)勢(shì)菌，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢查及分子生物學(xué)診斷確診分離到的兩株優(yōu)勢(shì)菌是肺炎克雷伯菌。隨后我們對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明本菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，且致病性較強(qiáng)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料。2013年9月諸城市水貂養(yǎng)殖戶送檢的頸部膿腫及肺部出血死亡的病貂兩只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。40只體重為20-25g的潔凈級(jí)昆明小白鼠購(gòu)自山東泰邦生物制品有限公司。

1.1.3 主要試劑。PCR反應(yīng)所用試劑（10×PCR Buffer、dNTPs、Taq酶）、pEASY-T1 cloning

vector 購(gòu)自大連寶生物工程公司（Takara）；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、細(xì)菌DNA提取試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；DNA Marker DL2000購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；微量生化發(fā)酵管和藥敏紙片購(gòu)自杭州天河微生物有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB普通液體培養(yǎng)基、綿羊血（5%）瓊脂培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自行配制；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)。無(wú)菌取2只病死水貂的頸部膿腫液、肺臟，按常規(guī)方法將病料劃線接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、綿羊血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。挑取典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)并進(jìn)行革蘭染色、芽孢染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.2.2 生化鑒定。采用細(xì)菌生化鑒定管對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行生化鑒定，接種后的發(fā)酵管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h，統(tǒng)計(jì)生化試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 16S-23S rRNA ISR基因的PCR鑒定。將2個(gè)分離株于普通LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌全基因組。根據(jù)文獻(xiàn)［12］設(shè)計(jì)16S rRNA 3'-23S rRNA 5'間序列PCR擴(kuò)增的通用引物。PCR產(chǎn)物主帶膠回收后與pEASY-T1載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli 感受態(tài)DH5α，37℃溫箱培養(yǎng)12h，挑取單菌落增菌過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI /XhoI雙酶切鑒定后得到的陽(yáng)性克隆送生工生物（上海）公司測(cè)序。將2株分離菌的16S-23S rRNA ISR基因測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行檢索。

1.2.4 藥物敏感試驗(yàn)。將分離純化的2株菌接種于普通LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌，24h后取菌液進(jìn)行平板涂布，將藥敏片平鋪于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)24h后測(cè)量各種抗菌藥物的抑菌環(huán)直徑。按照倪語(yǔ)星等[11]的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.5 半數(shù)致死量（LD50）測(cè)定。測(cè)定2株分離株對(duì)小白鼠的LD50，分離菌在37℃搖床搖菌18h后，分別將菌液作10-1-10-10稀釋后，采用平板涂布計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液細(xì)菌數(shù)。將菌液作10-1，10-2，10-3，10-4稀釋后經(jīng)腹腔注射接種小白鼠（雌雄各半，隨機(jī)分組），每稀釋度4只，0.2 mL/只，對(duì)照組注射等量培養(yǎng)18h的LB液體培養(yǎng)基。攻毒后連續(xù)觀察7d，采用Karber法計(jì)算LD50并觀察小鼠死亡情況，剖檢病死小鼠，采集臟器按照上述方法進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果及細(xì)菌形態(tài)觀察

分離獲得的2株菌在普通瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可見(jiàn)直徑約1-2mm具有黏性的菌落，用接種環(huán)挑之易拉成絲，生長(zhǎng)豐盛。在普通瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形隆起、濕潤(rùn)、邊緣整齊的乳白色大菌落。在綿羊血瓊脂上形成單一灰白色、表面光滑、黏稠的小菌落，不溶血。麥康凱瓊脂上菌落呈粉紅色。2株分離菌革蘭染色陰性，具有明顯莢膜，無(wú)芽孢，菌體兩端鈍圓的中等大小的短桿菌，初步判定為K.pneumoniae，2株菌分別命名為KP-ZC1，KP-ZC2。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)2株分離菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)生化鑒定，2株菌鑒定結(jié)果一致，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。參照腸桿菌科細(xì)菌鑒定手冊(cè)，分離的2株細(xì)菌符合Kpn的生化特性。

表1分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.3 16S-23S rRNA ISR基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

提取2株分離菌的基因組DNA，對(duì)其16S-23S rRNA ISR基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示在941bp（主帶）和1200bp左右處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期

相符（圖1a）。主帶純化后的目的片段與pEASTT1載體連接轉(zhuǎn)化后獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定（圖1b）。測(cè)序結(jié)果表明KP-ZC1，KP-ZC2與K.pn KCTC 2242（GenBank CP002910 ）同源性為99.9%。證明兩株分離菌均屬于肺炎克雷伯菌。

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

分別測(cè)量2株分離菌的抑菌環(huán)直徑，取其平均值2株菌的藥敏結(jié)果相似（表2）。結(jié)果表明分離株對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、頭孢他啶高度敏感。

2.5 分離株的致病情況及LD50測(cè)定結(jié)果

剖檢對(duì)照組死亡小鼠可見(jiàn)其肝臟腫脹出血，脾臟充血，腸道出現(xiàn)彌漫性出血，對(duì)照組7d內(nèi)無(wú)異常，對(duì)小鼠內(nèi)臟器官進(jìn)行細(xì)菌分離，分離到K.pn，證明小鼠感染的細(xì)菌是K.pn且其致病性較強(qiáng)。平板涂布計(jì)數(shù)測(cè)得KP-ZC1、KP-ZC2原菌液數(shù)分別為1.54×1010cfu/mL、1.72×1010cfu/mL，LD50采用Karber法計(jì)算。公式如下：LD50=Lg-1[Xm－i×（Σp－0.5）]，Xm為最大劑量組對(duì)數(shù)值，i為相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值，Σp為各組動(dòng)物死亡率之和。計(jì)算可知兩個(gè)分離株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量分別為4.9×106cfu/mL，3.1×106cfu/mL（表3）。

表2 2株分離菌株的藥物敏感性（平均值）

表3分離株對(duì)小白鼠的LD50

3 討論

近年來(lái)，肺炎克雷伯氏菌引起人和動(dòng)物疾病的報(bào)道在迅速增加，該菌導(dǎo)致了家兔的腸炎[13]、肺炎，雛雞肝臟壞死，大熊貓的腹瀉、肝炎，豬腹瀉等，并引起水貂、麝鼠、竹鼠、牛等大量死亡[14-15]，對(duì)水貂等毛皮動(dòng)物的報(bào)道較少，其危害日益加劇，應(yīng)引起足夠重視。

16S-23S rRNA ISR序列是位于16S rRNA基因與23S rRNA基因間的區(qū)間序列，由16S-t RNA spacer、tRNA、tRNA－23S rRNA spacer 3部分組

成[16]。國(guó)外研究已經(jīng)證實(shí)16S-23S rRNA ISR序列的進(jìn)化率要強(qiáng)于16S rRNA基因10倍[17]，因此，16S-23S rRNA ISR更適合區(qū)分不同細(xì)菌的特點(diǎn)。本研究在傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法的基礎(chǔ)上又對(duì)兩株優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了16S-23S rRNA ISR基因序列分析，更進(jìn)一步證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，因此應(yīng)用基因測(cè)序方法鑒定臨床上容易混淆的疾病準(zhǔn)確性強(qiáng)，值得借鑒。

本文分離到的兩株優(yōu)勢(shì)菌從培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化特性、致病性等都與肺炎克雷伯菌相似?；驕y(cè)序結(jié)果表明，兩株分離菌同源性與相應(yīng)的K.pn同源性高達(dá)99.9%，證明兩株優(yōu)勢(shì)菌均為肺炎克雷伯菌。藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對(duì)阿米卡星、頭孢曲松、頭孢他啶高度敏感，對(duì)新霉素、大觀霉素、安普霉素、替米考星等中度敏感，而對(duì)鏈霉素、土霉素等等不敏感，這可能與抗生素的濫用有關(guān)，因此建議水貂養(yǎng)殖戶在疫情發(fā)生時(shí)，應(yīng)當(dāng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇最適藥物進(jìn)行治療，避免盲目投藥，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)。選擇敏感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小白鼠對(duì)分離菌株進(jìn)行致病性實(shí)驗(yàn)，該菌可引起小白鼠肺炎，肝臟、脾臟、腸道出血等癥狀，確定分離到的兩株優(yōu)勢(shì)菌是導(dǎo)致水貂死亡的主要病原菌，其半數(shù)致死量分別為4.9×106cfu/mL、3.1×106cfu/ mL，表明從肺部分離到的肺炎克雷伯菌致病性較強(qiáng)，這可能與該菌的致病機(jī)理有關(guān)，它是呼吸道感染的重要病原體，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，便經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺部而引起大葉或小葉融合性實(shí)變，引起重癥肺炎。

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Isolation，Identif cation and Virulence Determination of Klebsiella pneumoniae from mink

Wang Jian，Han Yaodong

（Zouping Animal Husbandry and Veterinary Bureau，Zouping，Shandong 256200）

[Objective]To identify the main bacterial pathogens causing mink deaths in a mink farm.[Method]Two dominant bacterial isolates got from the dead minks submitted were subjected to culture and morphological observation，biochemical tests，drug susceptibility test，pathogenicity test and 16S-23S rRNA ISR sequencing.[Result]Results revealed that 16S-23S rRNA ISR gene of the two isolates shared 99.9% homology with K.pneumoniae

train. Drug sensitive test indicated that the bacterial isolates were highly sensible to sulbactam and ceftriaxone. Pathogenicity tests showed that the isolates could cause high morbidity or mortality in healthy mice and its median lethal dose was 4.9×106cfu/mL and 3.1×106cfu/mL respectively.[Conclusion]The two isolates belonged to Klebsiella peneumoniae and were the main pathogen causing mink deaths.

Mink；Klebsiella pneumoniae；Isolation and Identif cation；Virulence

S852.612；S858.92

：B

：1005-944X（2014）10-0066-04

楊廣