應(yīng)用隨機(jī)引物法鑒定偽劣羊肉卷中的肉種成分

王 昱，葉自霞，聶福平，肖進(jìn)文，楊 俊，袁增壯，王國民，李應(yīng)國，李正國

（1.重慶大學(xué)，重慶 400044；2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶 400020；3.西南大學(xué)，重慶 400716）

應(yīng)用隨機(jī)引物法鑒定偽劣羊肉卷中的肉種成分

王 昱1，2，葉自霞3，聶福平1，肖進(jìn)文1，楊 俊1，袁增壯3，王國民1，李應(yīng)國1，李正國1

（1.重慶大學(xué)，重慶 400044；2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶 400020；3.西南大學(xué)，重慶 400716）

為鑒定市場抽檢的來源不明的偽劣“羊肉卷”中的肉種成分，采用隨機(jī)引物法，PCR擴(kuò)增肉制品DNA，將陽性產(chǎn)物回收、克隆并測序，然后根據(jù)序列信息設(shè)計特異性的熒光定量引物進(jìn)行再次鑒定。結(jié)果表明，獲得了針對偽劣“羊肉卷”的陽性克隆，序列比對表明樣品中含有北極狐或火狐肉成分，經(jīng)特異性的熒光定量PCR確認(rèn)樣品為火狐肉。結(jié)果表明，可以應(yīng)用隨機(jī)引物PCR鑒定偽劣“羊肉卷”中的肉種成分。

隨機(jī)引物法；肉制品；物種成分；鑒定

近來一些不法商販為謀取暴利，常以禽肉冒充豬肉，以豬肉冒充牛、羊肉等手段摻雜摻假[1]，擾亂市場秩序，損害消費者的健康和利益，并且違背了部分人的宗教信仰[2]。公安部于2013年2月公布了10起打擊食品安全犯罪典型案例[3]，其中有5起與肉制品的制假有關(guān)。目前，常規(guī)的方法主要是通過肉制品的味道、色澤、紋理等辨別肉類來源，但肉制品經(jīng)過加工后失去了原有的質(zhì)地和特征，增加了肉品來源鑒定的難度[4]。在近日的工商委托檢測中，我們發(fā)現(xiàn)采用現(xiàn)有的檢測標(biāo)準(zhǔn)，如SN/ T2051-2008、GB/T 25165-2010等，所得結(jié)果均為陰性，樣品來源不明。為此，亟待一種針對未知來源樣品的廣譜的肉種鑒定方法。

現(xiàn)有的肉種來源鑒定方法主要利用特異性的引物和（或）探針進(jìn)行PCR，得以鑒定。孫艷華[5]等人用PCR法檢測熟肉制品中肉類來源，結(jié)果表明，建立PCR法僅需20 mg的樣品，檢出限為2×10-6g。沙才華[6]等人用三重PCR鑒別肉制品中豬和牛源性成分，結(jié)果可同時檢測牛豬成分的含量為0.1ng/μL，并在6份樣品中檢測出1份摻假制品。吳登俊[7]運用PCR-RFLP技術(shù)鑒別混合牛肉及制品的來源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24個品牌的牦牛肉干制品中僅有3個品牌是牦牛肉，有6個品牌是黃牛肉制品，還有4個品牌是水牛肉制品。侯東軍[8]

等用LAMP法鑒定牛羊肉中的摻雜肉，結(jié)果可檢出牛肉中0.01%～2%的豬肉成分。趙冉[9]建立雙重?zé)晒釶CR法檢測動物產(chǎn)品中豬源性和牛源性成分，結(jié)果牛肉和豬肉的檢測限均為10-5，與相應(yīng)的單重?zé)晒釶CR的檢出限一致。特異性引物探針可以快速地鑒定肉種來源，但是卻只能鑒定引物探針預(yù)設(shè)好的已知肉類。由于肉制品的摻假現(xiàn)象的復(fù)雜性，被摻雜的常常是不為人知的肉類，如果僅僅有常用的豬牛羊馬等引物探針去檢測，不僅會出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，也常出現(xiàn)無法檢出的現(xiàn)象。

隨機(jī)引物PCR是以PCR為基礎(chǔ)，使用隨機(jī)寡核苷酸鏈作引物，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。目前，隨機(jī)引物PCR多用于RAPD標(biāo)記分型[11-12]、動植物細(xì)菌[13]、病毒[14]的鑒定以及寄生蟲[15]的分型。Yuri Y[13]等人用隨機(jī)引物對肺炎鏈球菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌以及鼠疫耶爾氏菌等有機(jī)體進(jìn)行了鑒定。Amy L Clem[16]等用3端隨機(jī)引物對人類血漿病毒有無腺病毒、柯薩奇病毒和呼吸道合胞體病毒進(jìn)行了鑒定，檢出限為1000 PFU/mL。Farooq U[17]等用隨機(jī)引物法區(qū)分了不同株的惡性瘧原蟲可引起不同程度的瘧疾。目前，國內(nèi)外還沒有關(guān)于運用隨機(jī)引物PCR技術(shù)對肉制品來源鑒定的報道。本文擬借鑒用于未知微生物鑒定的隨機(jī)引物PCR，對未知肉樣DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，加以鑒定。

1 材料及方法

1.1 材料

待鑒定的肉樣一共兩份，均為某市公安局2013年度的打假行動中抽取的樣品，具體來源不明。兩袋樣品均為10kg/袋包裝，打開后呈現(xiàn)片狀外觀，狀態(tài)良好，無腐敗現(xiàn)象。樣本置-20℃冰箱低溫保存。

1.2 引物

研究用引物見表1，均由大連寶生物公司合成。

1.3 主要試劑

營養(yǎng)肉湯，購自北京路橋技術(shù)有限公司；深加工食品DNA提取試劑盒，購自北京TIANGEN公司；Taq DNA Polymerase和dNTP購自北京Promega公司；QIAAquick Gel Extration kit，購自德國QIAGEN公司；pMD-19T載體試劑盒和SYBR? Premix Ex Taq? （Tli RNaseH Plus） （RR420A），購自大連寶生物公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理及核酸提取。將未知來源的肉制品隨機(jī)挑選不同部位，做成不同小樣，然后分別剪碎，用PBS溶液（含5%吐溫20）振蕩洗去表明添加的佐料及油脂，經(jīng)液氮冷凍后，用研缽碾碎成粉末狀，備用。使用深加工食品DNA提取試劑盒提取DNA，過程如下：稱取樣品100mg，加入500μL的GMO1和20μL的Proteinase K（20 mg/mL），渦旋振蕩1min；56℃孵育1～12h，至裂解完全；加200μL的GMO2，混勻，渦旋振蕩1min，靜置10min；12000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；加入0.7倍的異丙醇，混勻，12000 r/min離心3min，棄上清；加700μL 70%的乙醇，震蕩5s，12000r/min離心2min，棄上清，重復(fù)此步驟；開蓋倒置5～10min，晾干殘余的乙醇；加入20～30μL洗脫緩沖液TE，渦旋震蕩1min，即獲得DNA模板。

1.4.2 PCR擴(kuò)增、回收及克隆。按如下要求配置100μL體系的反應(yīng)液：10μL 10×PCR緩沖液；2μL的10mmol/L dNTP Mix，終濃度為0.2 mmol/L；6μL的25 mmol/L MgCl2，終濃度為1.5 mmol/L；2μL的5U/μL Taq聚合酶，終濃度為0.1 U/μL；9μL的25μmol/L隨機(jī)引物，終濃度為2.25μmol/

L；66μL的滅菌水；5μL的DNA模板。按如下條件進(jìn)行DOP PCR擴(kuò)增：第一階段，95℃預(yù)變性5min，共1個循環(huán)。第二階段，94℃變性1min；30℃退火1min30s；72℃延伸3min（將增溫速率設(shè)置為5%，即0.2℃/s），共5個循環(huán)。第三階段，94℃變性1min；55℃退火1min；72℃延伸2min（從第2個循環(huán)開始每個循環(huán)增加14s），共35個循環(huán)。產(chǎn)物用QIAAquick Gel Extration kit進(jìn)行膠回收，方法同試劑盒說明書?；厥盏腄NA片段用pMD-19T載體試劑盒進(jìn)行目的基因的連接及克?。涸赑CR管中依次加入5.0 μL的solution I，0.5μL的vector 以及4.5μL的DNA模板，在16℃條件下反應(yīng)3～12 h。然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，藍(lán)白斑篩選陽性克隆。

表1研究用引物列表

1.4.3 插入子的鑒定。從平板上挑取單菌落（白斑），在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)過夜。按如下要求配置25μL體系的反應(yīng)液：2.5μL的 10×PCR緩沖液；0.5μL的10 mmol/L dNTP Mix，終濃度為0.2 mmol/L；1.5μL的25 mmol/L MgCl2，終濃度為1.5 mmol/L；0.5μL的5U/μL Taq聚合酶，終濃度為0.1 U/μL；各1μL的10μmol/L上下游引物（M13 primer），終濃度為0.4 mol/L；18 μL的滅菌水；1μL 的菌液。按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；72℃延伸5min。然后，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為電壓110V，電流400mA，時間30 min。根據(jù)產(chǎn)物長度判斷是否為插入了外源片段的陽性克隆子。

1.4.4 測序和分析。將克隆的陽性質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，測序過程交大連寶生物公司完成。將測定的序列去除載體序列，然后使用BLASTn進(jìn)行序列比對，比對參數(shù)默認(rèn)。分析插入序列的同源序列，并和相關(guān)序列進(jìn)行進(jìn)化樹的繪制，繪制方法采用近鄰法。

1.4.5 熒光PCR再鑒定。為了鑒定未知肉制品是否為火狐或北極狐中的其中一種，針對火狐線粒體基因（NC_008434.1）和北極狐的ATP合成酶基因（AH014073.1）分別設(shè)計一對特異性引物（表1）。采用添加SYBR GREEN 染料法進(jìn)行再檢測。20 μL檢測反應(yīng)體系包括：0.25 umol/L 上/下游引物，5μL DNA 模板 以及 10 μL 2×SYBR? Premix Ex Taq預(yù)混劑。循環(huán)條件：95℃ 30s；95℃5s，60℃ 20s，40個循環(huán)。同時，從山東某養(yǎng)殖場購買火狐、白狐肉，提取核酸后作為陽性對照。檢測結(jié)果以Ct值大小和擴(kuò)增曲線綜合判定。

2 結(jié)果

2.1 隨機(jī)PCR及克隆制備

相同DNA樣本的不同隨機(jī)PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖膠上均呈彌散條帶（圖1），其中DOP-PCR的產(chǎn)物在100到200之間有一濃度很大的集中擴(kuò)增產(chǎn)物，而另兩個隨機(jī)PCR的產(chǎn)物整體濃度偏低，沒有集中的擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增條帶。故選取DOP-PCR產(chǎn)物的集中擴(kuò)增區(qū)，進(jìn)行切膠回收。如圖2所示，膠回收的產(chǎn)物連接到pMD19T載體上后，克隆子經(jīng)M13引物鑒定后，有外源插入的克隆子長度大于130bp（泳道3），而沒有外源片段插入的克隆子產(chǎn)物長度為130bp（泳道1、2、4、5、6）。陽性質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒的長度在瓊脂糖電泳上略為有差異，陽性質(zhì)粒略長于陰性質(zhì)粒。結(jié)果表明，DOP引物的PCR擴(kuò)增比另外兩個引物要好。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過克隆后，獲得了包含插入序列的陽性克隆（圖3）。

圖1隨機(jī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖2.克隆子的插入鑒定

圖3陽性質(zhì)粒和陰性克隆子

圖4陽性克隆的序列信息及Blast結(jié)果

2.2 序列分析

陽性克隆的序列如圖4所示，經(jīng)Blast分析后，克隆子的序列和北極狐（Alopex lagopus）和赤狐（Vulpes vulpes）的微衛(wèi)星序列相似度分別高達(dá)92%和93%。然后，以牛的微衛(wèi)星序列為對照，包括了犬微型序列的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，克隆子形成兩個差異度極小的分支，與赤狐、北極狐聚類成一支（圖5）。據(jù)此，推測該肉制品的可能來源為狐屬動物。

2.3 熒光定量PCR檢測

如圖6所示，赤狐體基因的特異性引物能特異性擴(kuò)增未知肉制品DNA，擴(kuò)增曲線呈典型的S型，Ct值為24.1。然而，針對北極狐ATP合成酶基因的引物未能擴(kuò)增，Ct值大于總循環(huán)數(shù)（40），且沒有特征性擴(kuò)增曲線。同時，針對赤狐肉（Ct值15.2）和白狐肉（Ct值為17.1）的對照擴(kuò)增正常。結(jié)合序列測定結(jié)果，可以認(rèn)定該未知來源的肉制品為赤狐肉。

3 討論

由于市場的混亂和信用體系的缺失，我國的肉制品的摻假現(xiàn)象愈演愈烈[1]。如何對各種市售肉制品的來源進(jìn)行肉種成分鑒定，已經(jīng)成為維護(hù)正常流通秩序、保證消費安全的難題。

圖5陽性克隆子的發(fā)育進(jìn)化樹

圖6熒光定量PCR鑒別檢測未知來源“羊肉卷”成分

本研究中，我們首先對送檢的肉制品采用食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測試劑盒和檢測方法進(jìn)行了雞、馬、牛、羊、兔、豬以及驢源成分的PCR檢測，均未見特異性的擴(kuò)增。在排除了DNA模板和PCR反應(yīng)體系的問題后，初步認(rèn)為該未知來源肉制品并非雞、馬、牛、羊、兔、豬和驢中的任何一種。為此，我們采用了文獻(xiàn)報道的隨機(jī)引物法對樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增。對集中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，獲得了樣品的大致基因信息。GACCATCTAGCGACCTCCACMNNMNM引物[18]和VVVVVVVVAA引物[16]均沒有獲得文獻(xiàn)報告的擴(kuò)增效果，條帶極弱。而引物CCGACTCGAGINNNNNNATGTGG[19]的擴(kuò)增結(jié)果較為理想，在200 bp左右得到了集中的擴(kuò)增產(chǎn)物，由此，通過TA克隆實現(xiàn)了樣品基因序列的獲取。陽性克隆子的序列經(jīng)比對分析表明為火狐或北極狐的微衛(wèi)星基因序列。由于兩個物種的微衛(wèi)星序列有著相當(dāng)高的同源性，故需采用別的基因來驗證未知肉制品是否為其中的一種。熒光定量PCR沒有針對陽性克隆子的序列本身進(jìn)行引物設(shè)計，而是針對火狐及北極狐的線粒體及ATP合成酶基因設(shè)計引物，是為了從另一個側(cè)面來鑒定樣品的真正來源。定量PCR的檢測結(jié)果從另一個側(cè)面證實了克隆子的來源是火狐而非北極狐。

采用隨機(jī)引物法進(jìn)行PCR鑒定未知來源的肉制品物種成分，雖然可以實現(xiàn)廣譜檢測，理論上不會漏掉摻入的任何一種成分，但是將該方法應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)化檢測尚有一定的距離。主要的問題在于，操作步驟較為繁瑣，不同的試驗條件下得到的結(jié)果較難標(biāo)準(zhǔn)化。而且由于不知道待鑒定的肉樣是何物種，無法在隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增以及后續(xù)的熒光定量檢測中設(shè)定陽性檢測對照，檢測過程類似一個“黑匣子”。試驗中我們也發(fā)現(xiàn)，由于隨機(jī)引物PCR的產(chǎn)物較為復(fù)雜，呈現(xiàn)彌散的狀態(tài)，對回收和克隆的要求極高。由于回收的產(chǎn)物濃度低，長短不一，即便獲得了大量的陽性克隆子，也會出現(xiàn)相似序列不止一到兩種的情況，因此也需要結(jié)合常規(guī)方法進(jìn)行再次確認(rèn)。本文成功采取另選基因（線粒體基因和ATP合成酶基因）設(shè)計熒光定量引物的方法，對序列比對的結(jié)果進(jìn)行再鑒定。由此可見，隨機(jī)引物PCR法可望用于未知來源肉制品的肉種成分鑒定。

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Application of Random Primer Method for the Identif cation of Species Composition in Fake “Sliced Mutton”

Wang Yu1，2，Ye Zixia3，Nie Fuping1，2，Xiao Jinwen2，Yang Jun2，Yuan Zenzhuang3，Wang Guoming2，Li Yingguo2，Li Zhengguo1

（1. Chongqing University，Chongqing 400044；2.Chongqin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020；3. College of Animal Science and Technology，Southwest China University，Chongqing 400715）

To identify species composition of meat and meat products sampled from market，random primer method was used for PCR amplif cation of meat DNA，the positive products were recovered，cloned and sequenced，and then the specif c real time PCR primers were designed according to the sequence information for re-identif cation. Positive clones were obtained from the sliced mutton，and sequence alignment indicated that the sliced mutton sample contained Alopex lagopus or Vulpes vulpes meat ingredients. The Vulpes vulpes meat ingredient was conf rmed in the sliced mutton sample by specif c quantitative PCR. The results showed that the random primer PCR could be applied to the identif cation of species origin of meat and meat products .

random primer method；meat product；species composition；identif cation

TS251.7

：A

：1005-944X（2014）10-0074-06