我國部分省份豬流行性腹瀉的流行病學監(jiān)測

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

我國部分省份豬流行性腹瀉的流行病學監(jiān)測

張 志，董雅琴，劉 爽，吳發(fā)興，邵衛(wèi)星，李曉成

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

[目的]為摸清我國豬群流行性腹瀉的感染狀況，[方法]從2011年底到2014年3月，對云南、廣西等29個省份開展了豬群腹瀉疫情流行病學調(diào)查，采集、收集了發(fā)生腹瀉癥狀的發(fā)病豬群樣品（新鮮糞便、腸道組織等），進行了豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等多種病原檢測。[結(jié)果]在7021個調(diào)查豬場中，出現(xiàn)腹瀉的陽性豬場4060個（57.83%）。在收集的1383份腹瀉樣品中，利用RT-PCR方法檢測到PEDV陽性樣本686份（49.58%），其中腹瀉發(fā)病豬樣品中PEDV的檢出率為67.82%，675份組織樣品共檢測出PEDV陽性樣本86份（12.75%）。[結(jié)論]這表明我國豬場PEDV的感染十分普遍。對S基因進行分子流行病學分析發(fā)現(xiàn)，我國PEDV流行毒株與已有PEDV毒株可以分為2個完全不同的進化分支G1和G2，G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株為主，G2則以2011-2013年流行毒株為主，流行毒株之間的同源性為97.8%-100%，與疫苗株CV777之間的同源性為94.3%-94.5%。

豬流行性腹瀉；流行病學調(diào)查；監(jiān)測

豬腹瀉是影響豬群生產(chǎn)的一種常見性多發(fā)病，其致病因素較多，病毒、細菌、飼料等多種病因均可引發(fā)本病。2010年下半年開始，我國部分省份的豬群開始出現(xiàn)大規(guī)模的腹瀉疫情，主要癥狀為豬水樣腹瀉、嘔吐和脫水等特征，各種年齡豬和不同品種的豬群都有易感性，但對哺乳仔豬的危害性更大，1周內(nèi)的仔豬一旦發(fā)病，死亡率往往可達80%～100%[1-2]。對發(fā)病樣品進行病原鑒定，很多學者從中檢測到了豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）[3-5]。2011年底至2014年3月，為進一步摸清我國豬群腹瀉的發(fā)生現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，找出主要致病病原，我們在江西、湖南、廣西、云南等29個省份動物疫病預防控制中心的配合下，對這29個省份的規(guī)模豬場開展了現(xiàn)場流行病學調(diào)查，針對豬群腹瀉疫情的發(fā)生情況以及疫苗的使用情況進行了問卷調(diào)查、現(xiàn)場核查和統(tǒng)計分析，并收集、采集腹瀉豬群的腸道（及其內(nèi)容物）和糞便樣品1383份進行PEDV等病原的檢測，調(diào)查結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品。樣品有2種：一是來自14個省份、192個發(fā)病豬場的1383份糞便、腸道及腸道內(nèi)容物樣品；二是來自12個省、60個屠宰廠的675份組織樣品（包括肝臟、肺臟、腹股溝淺淋巴結(jié)、頜下淋巴結(jié)、脾臟和腎臟）。

1.1.2 試劑。PEDV的RT-PCR引物由本實驗室自行設計。RNA提取試劑盒Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶AMV、Taq酶等購自Takara公司，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調(diào)查。2011—2013年，我們在江西、湖南、廣西、云南等29個省份共開展四輪次豬群腹瀉疫情的流行病學調(diào)查，共發(fā)放《豬群腹瀉等常見病流行病學調(diào)查表》8000份，針對腹瀉等豬群疫病的發(fā)生情況、疫苗使用情況進行了問卷調(diào)查、現(xiàn)場核查。調(diào)查內(nèi)容涉及發(fā)病情況、發(fā)病區(qū)域、總體發(fā)病率、死亡率以及現(xiàn)有疫苗的臨床免疫保護效果等，對返回的數(shù)據(jù)及時進行統(tǒng)計分析。

1.2.2 PEDV 核酸檢測

1.2.2.1 豬糞便樣品的處理和RNA的提取。每一份糞便按照1：5的比例加入PBS緩沖液，5000r/min 4℃離心10min，然后吸出上清液用于提取RNA和接種細胞。RNA的提取根據(jù)試劑盒的說明書進行，即取糞便懸液250μL于1.5mL的離心管中，加入750μL Trizol（Invitrogen公司），混勻，室溫放置5min；再加入200μL氯仿，振蕩混勻，室溫放置10min；12000r/min、4℃離心15min，取上清500μL，加等體積-20℃預冷的異丙醇室溫靜置10min或-20℃靜置30min，12000r/min、4℃離心10min；棄上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC處理水配制），8000～9000g離心5min；棄上清，倒置風干，用20μLDEPC處理水溶解，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 檢測引物。根據(jù)參考文獻[6]，設計2對引物，進行巢式PCR擴增，一擴引物的擴增產(chǎn)物預計為854 bp，序列為：L12：5’-ACACCTATAGGGCGCCTGTA-3’；L13：5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’；二擴引物的擴增產(chǎn)物應為412 bp，其序列為： PA： 5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’；PB：5’-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。引物由上海生工合成。使用時稀釋至20μm。

1.2.2.3 RNA病毒的檢測。首先制備cDNA，cDNA反應體系為：RNA 5μL，dNTP 4μL，5×AMV Buffer 4μL，反轉(zhuǎn)錄引物L131μL，AMV 0.5μL，HPRI 0.5μL，加入適量DEPC水，總體積為20μL。42℃恒溫水浴鍋中水浴1.5h，取出后放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR擴增：取反轉(zhuǎn)錄的cDNA 2.0μL作為模板，加入10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs（10 mmol/L）2μL，分別加入PEDV的引物L12和L13各0.5μL，Ex-Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O 17.25μL?；靹蚝蟛捎萌缦鲁绦蜻M行PCR擴增：94℃預變性3min；94℃40s，56℃1min，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。巢式PCR擴增：取上述PCR產(chǎn)物0.5μL，用引物PA和PB進行二次擴增，反應條件如下：94℃預變性3 min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃30s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物檢測。取10μL 一次和二次擴增的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察有無特異性條帶。

1.2.3 PEDV 分子流行病學分析

1.2.3.1 引物設計。根據(jù)GeneBank上的PEDV S基因序列，設計一對引物用于擴增S基因的S1片段，引物序列為：PDEV-S1-F：AAGTGGCGCTGTGATTGA和PDEV-S1-R：CAGAAAGAACTAAACCCATTGATA。擴增大小為1885bp。

1.2.3.2 S1片段的PCR擴增。取上述巢式PCR鑒定為陽性的RNA樣品，進行反轉(zhuǎn)錄，然后再進行PCR擴增，反應程序為：94℃預變性3min；94℃ 40s，56℃2min，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測。取10μL擴增的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中進行觀察有無特異性條帶，如果有陽性條帶，則送交上海生工進行測序。

1.2.3.4 分子流行病學分析。從Genebank上下載PEDV S基因相關序列作為參考序列，用DNA-

Star、MEGA6.0、CLUSTAL W1.83等分子生物學軟件比較和分析本試驗中PEDV陽性樣品的S1片段測序序列，分析PEDV流行毒株的變異和分子演化特征。

2 結(jié)果

2.1 流行病學調(diào)查結(jié)果

2.1.1 豬群腹瀉流行病學調(diào)查結(jié)果。2011—2013年，每年開展四輪次豬群腹瀉疫情的流行病學調(diào)查，共涉及29個省份，共發(fā)放流行病學調(diào)查問卷8000場次，實際回收問卷7021場次，主要類型為規(guī)模養(yǎng)豬場或養(yǎng)豬大戶，母豬存欄量一般為50-3000頭，并抽取10%-20%的豬場進行了現(xiàn)場核查（表1）。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，養(yǎng)殖場出現(xiàn)腹瀉臨床病例的比例較高，2012年最高，場發(fā)病率達71.16%，2013年明顯下降，場發(fā)病率為48.35%。腹瀉的發(fā)病與豬的日齡密切相關，仔豬的發(fā)病率、死亡率明顯高于種豬、育肥豬，種豬和育肥豬發(fā)生腹瀉以后，二者的死亡率極低，但仔豬發(fā)生腹瀉后，死亡率可達12.58%（2012年）。

2.1.2 PED疫苗臨床應用效果調(diào)查結(jié)果。2011—2013年腹瀉疫苗的臨床使用效果調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，滅活苗使用率較高，為40.2%～51.6%，高于活疫苗使用率，但2013年，兩種疫苗的使用率都有所下降，未使用疫苗的豬場明顯增加，但同年豬場腹瀉的發(fā)病率下降明顯，從調(diào)查結(jié)果來看，不管是接種滅活苗還是活疫苗，對降低腹瀉的發(fā)病率作用并不明顯，詳見圖1。

2.2 PED病原學檢測結(jié)果

2011—2013年對我國腹瀉豬群的組織樣品進行PEDV、TGEV和PRoV等三種常見病原學檢測，發(fā)現(xiàn)在三種導致腹瀉的病原中，PEDV的陽性率最高，2011年腹瀉樣品中PEDV的陽性率94.60%，2013年為17.60%（表2）。表明PEDV是導致我國腹瀉疫情的主要病原。另外，對來自屠宰場的675份組織樣品進行PEDV檢測，陽性率為12.75%。

2.3 PEDV流行毒株的分子流行病學特點

對13份PEDV陽性病料中PEDV流行毒株的S基因的S1片段進行序列測定，與GenBank中的參考毒株進行比較，發(fā)現(xiàn)：流行毒株之間的同源性為97.8%～100%，與疫苗株CV777之間的同源性為94.3%～94.5%，與GeneBank中公布的PEDV流行株之間的同源性為97.4%～99.6%，表明2011—2013年PEDV的流行毒株之間高度同源，而與疫苗毒株之間已經(jīng)發(fā)生較大變異（圖2）。

表1 2011—2013年我國豬群腹瀉流行病學調(diào)查結(jié)果

圖1 2011—2013年腹瀉疫苗的臨床使用效果調(diào)查結(jié)果

表2 2011—2013年我國腹瀉豬群病原學檢測結(jié)果

另外，與疫苗株相比，流行毒株有2個位置已經(jīng)發(fā)生了插入和缺失突變。第一個位置位于第166位堿基處，流行株均有12個堿基的插入突變，見圖3a；第二個位置位于第481位堿基處，流行株均有6個堿基的缺失突變，見圖3b。

進一步分析PEDV流行毒株的進化樹，發(fā)現(xiàn)我國PEDV流行毒株與已有PEDV毒株可以

分為2個完全不同的進化分支G1和G2，G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株為主，G2則以2011—2013年流行毒株為主，這些毒株包括來自韓國、泰國以及最近美國的流行毒株，詳見圖4。

圖2 PEDV流行株與疫苗株同源性比較

圖3a和3b PEDV流行毒株的插入和缺失突變圖

3 討論和分析

豬流行性腹瀉是豬場常見的一種高度傳播性疫病，其病理變化是豬出現(xiàn)嘔吐、水樣或黃白色糞便，豬只精神沉郁，食欲下降，急劇消瘦，在臨床上很容易與其他疫病鑒別。本試驗開展的流行病學調(diào)查時主要根據(jù)臨床和病理變化做出初步診斷。在調(diào)查的7021個豬場中，有4060個豬場（57.83%）發(fā)生過腹瀉，這表明豬場腹瀉非常普遍和嚴重，已經(jīng)成為嚴重危害豬場的重要疫病。從調(diào)查的省份來看，PEDV陽性省份已經(jīng)有29個省市，覆蓋了我國所有養(yǎng)豬的主要產(chǎn)區(qū)，由此可以看出，豬流行性腹瀉病毒廣泛存在，是近年來豬群腹瀉疫情的主要病原。

在本試驗中，我們發(fā)現(xiàn)無論是發(fā)病的腹瀉樣品還是屠宰場外觀健康的豬組織樣品，都可以檢測到PEDV的存在，特別是發(fā)病的腹瀉樣品中，PEDV的陽性率最高可以達到94.60%，即使屠宰場樣品PEDV的陽性率也為12.75%。Gao等[1]曾對我國北京、河北和浙江等15個豬場出現(xiàn)腹瀉的樣品進行了檢測，PEDV的陽性率為92.7%（267/288）；Wang等[7]2010-2012年共收集了42個豬場的217份仔豬腹瀉樣品，PEDV陽性率為80.6%，傳染性胃腸炎病毒8.3%。這說明PEDV的感染率已經(jīng)非常普遍，PEDV已經(jīng)成為初生仔豬腹瀉的主要傳染性病原。

通過S基因的遺傳進化分析，我們發(fā)現(xiàn)2011—2013年的PEDV流行毒株均位于同一個進化分支，與原來的CV777、DR13等毒株處于另一個進化分支截然不同，這一結(jié)果與文獻等[8-11]的結(jié)論類似。這說明目前PEDV的流行毒株與疫苗株之間有較大的差異，這種差異是否導致致病性、疫苗的免疫原性等變化尚待進一步研究。但通過本試驗中的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的傳染性胃腸炎-流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗、二聯(lián)活疫苗免疫接種效果與未免疫豬群出現(xiàn)腹瀉的差異不明顯，表明現(xiàn)有的PED疫苗并不能有效保護PED的發(fā)生和流行，為了有效地控制腹瀉疫情，研發(fā)安全、有效的疫苗刻不容緩。

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圖4我國2013年PEDV分離毒株的進化樹分析

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Survey and surveillance of porcine epidemic diarrhea in some provinces in China

Zhang Zhi，Dong Yaqin，Liu Shuang，Wu Faxing，Shao Weixing，Li Xiaocheng

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

A series of epidemic surveys and surveillances were carried out in 29 provinces in China during 2011-2013. Some diarrhea samples of feces ，intestines and its contents were collected and detected for porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），transmissible gastroenteritis virus（TGEV） and porcine rotavirus（PRoV）. The results showed that the total positive ratio of PEDV was 49.58%，whereas the positive ratio was 67.82% in diarrhea samples and 12.75% in healthy samples，suggesting the prevalence of PEDV was very common in pig farms. According to the molecular analysis with some

trains from GeneBank，the f eld strains of PEDV in the study could be classif ed into one subgroup with homology of 97.8%～100%，while vaccine strains of CV777，DR13 and some early strains were classif ed into another subgroup with homology of 94.3%～94.5% as compared with f eld strains.

porcine epidemic diarrhea；epidemic survey；surveillance

S852.65

：B

：1005-944X（2014）10-0047-05

李曉成