毛細管電泳在線富集技術(shù)在季銨鹽農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

張慶慶，王燕燕，張文芳

（1.中國人民公安大學刑事科學技術(shù)系，北京100038；2.北京市公安局法醫(yī)鑒定中心，北京100192）

毛細管電泳在線富集技術(shù)在季銨鹽農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

張慶慶1，王燕燕2，張文芳2

（1.中國人民公安大學刑事科學技術(shù)系，北京100038；2.北京市公安局法醫(yī)鑒定中心，北京100192）

季銨鹽類農(nóng)藥屬于極性強的堿性有機陽離子化合物，用常規(guī)氣相色譜方法分析較困難，而高效毛細管電泳很適合分離季銨鹽這類離子化合物。由于進樣量以及檢測器靈敏度的制約，毛細管電泳通常要使用在線富集技術(shù)提高其濃度檢測限。針對季銨鹽陽離子的特性，具體探討了用毛細管電泳分析此類陽離子化合物的幾種在線富集技術(shù)，也可為檢測其他類似分析物起到借鑒作用。

季銨鹽農(nóng)藥；毛細管電泳；陽離子；在線富集

一、引言

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的季銨鹽農(nóng)藥有百草枯（PQ）、敵草快（DQ）、燕麥枯（DF）、甲哌啶（MQ）和矮壯素（CQ），屬中低毒類農(nóng)藥，都是極性強的易溶于水的堿性有機陽離子化合物，易殘留，且易產(chǎn)生環(huán)境和健康風險問題。此類農(nóng)藥檢測方法有光譜法[1][2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3][4]、液相色譜紫外檢測法（LCUV）[5][6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[7][8]及酶聯(lián)免疫法（ELISA）[9][10]等。

用氣相色譜分析季銨鹽比較困難，需要用還原劑將其還原。目前主流的反相液相色譜分析，需在流動相中添加離子對試劑增加其在柱上的保留性，但離子對試劑會影響質(zhì)譜的檢測靈敏度。近年來，雖然已研制出了無須添加離子對試劑的親水性色譜柱，但PQ和DQ峰仍難基線分離，影響色譜的準確定量[11]。用毛細管電泳（CE）分離季銨鹽時，PQ和DQ則很容易就能基線分離，分離效率高、出峰快，很適合于分離檢測季銨鹽類極性化合物。但毛細管檢測光程短，檢測體積?。ㄖ挥幸合鄼z測池的1/100），最常配備的二極管陣列（PDA）檢測器的靈敏度（檢測限10-5～10-6mol/L）遠不及激光誘導(dǎo)熒光（LIF）檢測器（檢測限10-14mol/L）[12]。而且MQ和CQ不含紫外生色團，在使用紫外檢測器時，需用間接紫外檢測的方法，而間接檢測法本身的靈敏度不高[13]。CE-MS（毛細管-質(zhì)譜法）能解決定性的問題，同時檢測五種季銨鹽，但已有的方法靈敏度不是很理想[14]。針對靈敏度低的問題，在沒有高靈敏度檢測器的情況下，需考慮結(jié)合在線富集或離線預(yù)處理等方法提高靈敏度。而在線富集技術(shù)只需要調(diào)整背景緩沖液以及進樣程序就能將靈敏度提高幾個數(shù)量級，極大地降低了濃度檢測限，因此被廣泛運用于CE分析中。

能用于季銨鹽陽離子檢測的毛細管電泳富集模式有：（1）毛細管區(qū)帶電泳（Capillaryzoneelectrophoresis，CZE）。包括場放大堆積（Field-amplifiedsample stacking，F(xiàn)ASS）；大體積堆積（Large-volume sample stacking，LVSS）；pH-修飾堆積（pH-mediated-stacking）。（2）膠束毛細管電動色譜（Micellarelectrokinetic chromatography，MEKC）。包括常規(guī)的膠束電動（Nor mal-stacking MEKC）；掃集-膠束電動（Sweeing-M EKC）；陽離子選擇性耗盡進樣-掃集-膠束電動（Cation-selective exhaustive injection-sweepin g-micellarelectrokinetic chromatography，CSEI-sweeping-MEK C）。（3）等速電泳（Isotachophoresis，ITP）。

二、毛細管區(qū)帶電泳富集

（一）場放大樣品堆積（FASS）

將樣品制備在低電導(dǎo)基質(zhì)中，毛細管經(jīng)背景電解質(zhì)溶液（BGS）平衡后，壓力引進少量低電導(dǎo)溶液（通常是水），在毛細管進樣端形成一個高電場的區(qū)域。電動進樣時，分析物離子會很快通過低電導(dǎo)區(qū)域遷移到達樣品區(qū)帶和BGS的邊界，隨后因電場強度下降導(dǎo)致遷移速度變慢從而聚焦在邊界附近。FASS富集效果顯著，操作簡單，但若沒有水柱，分析物離子容易堆積在頂端進樣口處，造成富集效應(yīng)退化。

圖1 毛細管電泳場放大分離季銨鹽示意圖

季銨鹽在pH1～14的范圍內(nèi)幾乎都能完全電離，成為高度溶劑化、質(zhì)子化的陽離子，而緩沖液pH值主要是影響毛細管壁硅羥基的電離進而影響電滲流（EOF）大小。Galceran[15]等分析了pH值、溫度、電壓、緩沖陽離子濃度、進樣模式等人對遷移時間、表觀淌度、峰高等參數(shù)的影響。另外，在緩沖溶液中添加一定比例的乙腈能改善PQ和DQ間的分離度和基線穩(wěn)定性[16]。為改善重現(xiàn)性，有時采用兩端同時加壓來避免因焦耳熱產(chǎn)生的氣泡[17]。

（二）大體積堆積（LVSS）

圖2 毛細管電泳大體積進樣分離季銨鹽示意圖

LVSS檢測季銨鹽時，需要加入十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等改性劑使電滲流逆轉(zhuǎn)。樣品溶解在低電導(dǎo)液中，毛細管充滿BGS后進樣，常采取整管進樣方式，將樣品溶液灌滿整根毛細管后，施加正向分離電壓。此時，電滲流朝向入口端，而陽離子分析物則朝向出口檢測端遷移，堆積在樣品區(qū)帶和BGS邊界，陰離子和中性離子向入口端遷移，慢慢地退出毛細管。仔細監(jiān)測工作電流，直至上升接近原始值的95～99%后改變電壓方向進行正常的電泳分離。變成負電壓后電滲流逆轉(zhuǎn)，推動逆流的陽離子向檢測端遷移。Nú?ez[18]結(jié)合固相萃取使用該富集方式檢測飲用水中三種季銨鹽除草劑。此外，LVSS也可以采用不改變電壓方向的方式進行，但BGS的pH＜3，此時電滲流受到抑制[19]。LVSS方式不能同時分離檢測陰離子和陽離子，更適用于檢測淌度不大的離子，且操作不容易控制。

（三）pH-修飾堆積（pH-mediated-stacking）

圖3 pH酸修飾富集分離季銨鹽示意圖

在FASS和LVSS中，為了實現(xiàn)富集，樣品采用水或者低電導(dǎo)緩沖液配制，而常見的生物樣本為電解質(zhì)溶液，離子強度大，需要繁瑣的前處理過程來進行提取和凈化。pH-修飾富集是對高電導(dǎo)樣本采用酸堿中和作用的一種富集方法，即用酸或堿中和樣品中的高電導(dǎo)基質(zhì)，形成低電導(dǎo)區(qū)帶而堆積樣品。這種技術(shù)可用于分離富集低濃度、高離子強度的樣品，能避免由于樣品區(qū)帶的導(dǎo)電性高于背景電解質(zhì)而導(dǎo)致的去堆積現(xiàn)象[20]。在高離子強度基質(zhì)的樣品電動進樣后，再電動進樣一段強酸，強酸中的質(zhì)子在電動進樣時快速向樣品區(qū)帶遷移，中和其中的弱酸根離子，使樣品區(qū)帶變成電中性，電導(dǎo)率降低，促使待測物離子的遷移速度加快，堆積在邊界處。該方式目前還沒有人應(yīng)用于季銨鹽農(nóng)藥檢測中。

三、毛細管膠束電動富集

（一）常規(guī)的膠束電動（MEKC）

圖4 常規(guī)的膠束電動毛細管色譜堆積分離季銨鹽示意圖

CZE是基于溶質(zhì)淌度差異進行分離的，而MEK C則是基于溶質(zhì)在膠束中的不同分配進行分離的。將樣品制備于低電導(dǎo)的緩沖溶液中，背景緩沖液含有能形成膠束的SDS（十二烷基硫酸鈉），再將毛細管充滿緩沖液，注射樣品溶液之后，施加正向電壓以MEKC模式分離，分析物在含有膠束的緩沖液中遷移堆積[21]。

（二）掃集-膠束電動（Sweeing-MEKC）

圖5 反向電壓掃集-膠束電動分離季銨鹽示意圖

Sweeping-MEKC中所有溶液要保持低pH值抑制電滲流，制備樣品用的基體溶液與背景緩沖溶液的導(dǎo)電性基本相同，樣品溶液中不加固定相。BGS是含表面活性劑的膠束緩沖液，樣品可溶解在沒有膠束的緩沖液中，當BGS和樣品溶液注入完成后，運行負電壓，陰離子向入口端移動，陽離子向出口端移動，SDS膠束進入毛細管樣品溶液區(qū)帶掃集分析物。趙燕燕[22]在檢測血清中的PQ時，比較分析了Swee ping-MEKC與紫外分光光度這兩種測試方法。

（三）陽離子選擇性耗盡進樣-掃集-膠束電動（CS EI-sweeping-MEKC）

圖6 陽離子選擇性耗盡電動分離季銨鹽示意圖

毛細管首先用不含膠束的BGS預(yù)處理，再引入高電導(dǎo)率的緩沖溶液（不含有機溶劑），隨后引進一段水柱施加正向電壓電遷移進樣（樣品制備在低電導(dǎo)率介質(zhì)中），之后將毛細管兩端置于含膠束的BGS下施加負電壓分離。該方法將掃集與場放大樣品技術(shù)聯(lián)用，先用電動進樣使樣品堆積，再用膠束掃集使樣品第二次富集，因此，能明顯地提高富集效果，方法選擇性強，適合樣品中痕量及超痕量組分的分離分析。因相反電荷分析物與SDS之間存在強烈的相互作用，CSEI-sweeping-MEKC在線陽離子濃縮用陰離子SDS膠束能提供高的選擇性富集[23]。Nú?ez[21]比較了MEKC、Sweeping-MEKC、CSEI-Sweeping-M EKC這三種在線富集方式，結(jié)果Sweeping-MEKC的富集倍數(shù)是500倍，而CSEI-Sweeping-MEKC的富集倍數(shù)達到了5萬倍，檢測限均小于1ug/ml。

四、毛細管等速電泳富集

圖7 毛細管等速電泳分離季銨鹽示意圖

用兩種淌度差別大的緩沖體系分別構(gòu)成前導(dǎo)離子（Leading ion）和尾隨離子（Terminating ion），將試樣像夾心餅干一樣夾在二者之間。因前導(dǎo)離子淌度最大，遷移最快，因而走在最前，其后是淌度次之的離子。所有溶質(zhì)都按前導(dǎo)離子的速度等速前移，并形成獨立的溶質(zhì)區(qū)帶而得到分離[24]。Kaniansky[25]和Walker[26]等人用該方法檢測過水樣中的PQ和DQ，但這種方式操作并不簡便，檢測限也不理想，因此使用不多。

五、結(jié)論

比較以上幾種富集模式，其中FASS的富集效果好且操作簡便；而CSEI-sweeping-MEKC的富集倍數(shù)最高，但操作較復(fù)雜；pH-修飾更適于生物高鹽樣本；LVSS能避免因離子淌度差異引起的進樣歧視問題。因此，實踐中可依據(jù)實際情況選擇適合的富集模式。應(yīng)用在線富集技術(shù)，無需對儀器進行改造就能降低濃度的檢測限，大幅提高儀器的檢測靈敏度，使得CE技術(shù)在分析領(lǐng)域有了更廣闊的應(yīng)用。

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A

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2014-07-15責任編校：江流

公安部科技強警基礎(chǔ)工作專項項目（編號：2013GABJC002）。