控制葡萄及其制品中赭曲霉毒素A的研究進展

王峻峻，張紅印，王海英，楊其亞，李超蘭

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，包括A、B、C、D（α）四種化學結(jié)構(gòu)非常相似的化合物，其中，赭曲霉毒素A（OTA）在自然界中最常見、毒性最強，對人類和動物的健康威脅最大。OTA的分子質(zhì)量為403.8g/mol，是一種酸性很弱的有機酸，pKa為7.1；易溶于極性有機溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水；OTA具有熱穩(wěn)定性，加工過程只能去除一小部分的OTA，甚至在250℃高溫下都不能完全降解[1]。

OTA具有腎毒性，且有一定致癌、致畸、致突變性[2]。2004年國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將其劃分為可能的人類致癌物，即2B類物質(zhì)。由于OTA廣泛存在于谷物、水果、飲料、咖啡等各種食品中，對人們的健康造成潛在的威脅，鑒于此，很多國家對其限量標準己經(jīng)做了規(guī)定（見表1）[3-6]。1996年Zimmerli和Dick首次報道了在葡萄酒中檢測出OTA，之后，澳大利亞、法國、西班牙等許多國家葡萄酒中都陸續(xù)檢出OTA[7-10]。由于歐洲人有喜好喝葡萄酒的飲食習慣，因此在歐洲葡萄酒被認為是僅次于谷物，能使人感染OTA的第二大食品[11]。世界上50%的葡萄酒來自意大利，同時，歐洲的葡萄酒出口量占世界葡萄酒出口量的70%，這些地區(qū)的葡萄酒污染將會影響整個葡萄酒市場，這就意味著對OTA的控制是一個世界性的問題[3，12]。因此，有效控制和解決食品中，尤其是葡萄及葡萄制品中OTA的污染，對提高食品安全、保證人類健康有非常重要的意義。葡萄采前的嚴格規(guī)范的管理是最有效的控制OTA污染的方法，但是如果污染已經(jīng)發(fā)生，必須采取一些適當?shù)姆椒▽⑵淙コ?。本文主要從對OTA產(chǎn)毒菌以及對已經(jīng)產(chǎn)生的OTA清除兩個方面分析了控制OTA的方法。

表1 主要組織和國家規(guī)定的食品中OTA的限量標準Table1 Regulatory concentration limits for ochratoxin A in wine and related foods

1 葡萄及葡萄制品中OTA的污染現(xiàn)狀

隨著科技的發(fā)展以及人們對OTA毒性的認識，葡萄及其制品中OTA被普遍研究，由于地域等原因，OTA的污染狀況輕重不一。Blesa等[13]通過對西班牙當?shù)?19個葡萄酒樣品取樣分析，發(fā)現(xiàn)OTA含量在＜0.01～0.76ng/m L。Serra等調(diào)查了葡萄牙11個葡萄園中的釀酒葡萄，只在3個葡萄園中檢測出了OTA，含量為0.035～0.061μg/kg[14]。Mikulikova等調(diào)查了2009～2010年捷克南摩拉維亞州的葡萄酒污染情況，發(fā)現(xiàn)有11%的樣品檢測出了OTA，含量在1.2～71.2ng/L[15]。Vega等調(diào)查了智利2007～2009年間的葡萄酒，發(fā)現(xiàn)只有2.9%的酒樣中含有OTA[16]。Brera等對意大利不同地域、不同品種的葡萄酒在1988～2004年間OTA的污染情況研究時，發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒中OTA的平均含量最高（7.50ng/m L），Var等在土耳其地區(qū)也發(fā)現(xiàn)紅葡萄中OTA污染相對最為嚴重，且86%的葡萄酒樣品中含有OTA，含量為＜0.006～0.815ng/m L[17-18]。而地中海地區(qū)的紅葡萄酒中OTA污染更為嚴重，Rem iro等在99%的樣品中都檢測出了OTA[19]。Ponsone等通過對阿根廷的紅葡萄汁、紅葡萄酒以及葡萄干中的OTA含量研究，發(fā)現(xiàn)葡萄干中污染最為嚴重，其OTA污染量為0.26～20.28ng/g，遠遠超過紅葡萄汁和紅葡萄酒中污染OTA的平均含量——分別為0.12、0.37ng/m L[20]。Quintela等調(diào)查發(fā)現(xiàn)1995～2008年間里奧哈（Rioja A lavesa）地區(qū)的葡萄酒的OTA平均污染量為0.035μg/L，然而在2009年對此地區(qū)生產(chǎn)的葡萄酒再次調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，OTA平均含量上升為0.077μg/L[21-22]。Valero等調(diào)查了特殊類型的葡萄酒中OTA的污染情況，發(fā)現(xiàn)污染的葡萄酒中20%超出了歐盟規(guī)定的限量標準（2μg/kg），但是在冰酒、貴腐葡萄酒以及晚收葡萄酒中均沒有檢出OTA[23]。

與之相比，我國對當?shù)仄咸丫莆廴綩TA的調(diào)查相對較少，其中Zhang等在1999～2009年的十年間，對我國大陸主要幾個地區(qū)的119種葡萄酒（包括干酒、冰酒）取樣研究，結(jié)果顯示OTA污染較為嚴重，OTA的污染量為＜0.1～5.65μg/L，且東北部地區(qū)OTA污染最嚴重，平均含量為2.18μg/L[24]。我國是一個葡萄酒消費大國，每年都會有大量的進口葡萄酒流入市場，陳杰等分析了寧波進口的84種來自不同地區(qū)的葡萄酒中OTA的含量，發(fā)現(xiàn)OTA檢出率為100%（檢測限0.05ng/m L），含量為0.14～1.10ng/m L，如若按照0.2ng/m L的限量標準，則有71.43%的進口葡萄酒中OTA超標[25]。因此在我國，葡萄酒中OTA的污染狀況應引起相關監(jiān)管部門的重視，并需及時制定進口葡萄酒主要污染物風險評估系統(tǒng)及殘留限量要求。

2 對OTA產(chǎn)生菌的控制

2.1 葡萄中OTA主要產(chǎn)生菌

青霉和曲霉是葡萄中主要的OTA產(chǎn)生菌，基于目前的研究，炭黑曲霉是其中污染數(shù)量最多、產(chǎn)毒量最大的菌種。西班牙學者Belli等連續(xù)三年（2001、2002、2003年）對10個果園的不同生長期的不同種類葡萄取樣研究，發(fā)現(xiàn)黑曲霉是葡萄主要的致病菌，但是只有2%～7%黑曲霉能夠產(chǎn)生OTA，而78%～100%炭黑曲霉能夠產(chǎn)生OTA，且產(chǎn)毒量大于黑曲霉，Tjamos等在對希臘葡萄園以及葡萄干中的霉菌進行分析時，也得到類似的結(jié)論[26-27]。同樣，Leong等研究了澳大利亞葡萄的污染狀況，在分離到的800多株霉菌中，黑曲霉占大多數(shù)，但產(chǎn)毒菌株均為炭黑曲霉[28]。Cabanes等在分析引起白葡萄酒污染的致病菌時，發(fā)現(xiàn)其中的產(chǎn)毒菌也只有炭黑曲霉[29]。在我國，何云龍等從煙臺赤霞珠中分離到了3株炭黑曲霉，其都能在玉米顆粒培養(yǎng)基上產(chǎn)OTA，但是在葡萄上不產(chǎn)OTA[30]；隨后蔣春美等分析了葡萄中分離到的189株霉菌，發(fā)現(xiàn)青霉和曲霉的污染率最高，且產(chǎn)毒率分別為9.8%和27%[31]。

2.2 控制OTA產(chǎn)毒菌的生長及產(chǎn)毒

霉菌在葡萄上產(chǎn)生OTA，不僅與葡萄的生長期密切相關，而且與菌株以外其他因素密切相關，如降雨量、溫度、土質(zhì)、風量等。然而這些因素并不是獨立的，它們之間相互影響又會產(chǎn)生更多不同的效果。同時因為OTA是霉菌的次級代謝產(chǎn)物，所以霉菌生長最適溫度、濕度并不等于最大產(chǎn)毒量的溫度、濕度，這又為實際研究增加了難度[32]?？傊@得葡萄園中的產(chǎn)毒菌株，尤其是炭黑曲霉菌株，并結(jié)合當?shù)仄咸训纳L環(huán)境，才能針對性的研究并控制葡萄及其制品中的OTA含量。

不同的OTA產(chǎn)毒菌，生長的條件和產(chǎn)毒條件是不同的，青霉一般適宜生長在溫度低于30℃，水分活度低于0.8的環(huán)境下；赭曲霉適宜在溫和的溫度，且水分活度高于0.8的環(huán)境中生長；而葡萄中最易污染的炭黑曲霉、黑曲霉，分別適宜在30℃左右的溫度下生長，且容易感染成熟果實[33]。劉彬發(fā)現(xiàn)赭曲霉菌在葡萄干生長的最適溫度為15～25℃，當溫度高于30℃和低于2℃時其生長和OTA的產(chǎn)生都停滯；溫度為3～10℃時，赭曲霉菌生長緩慢，OTA產(chǎn)生水平也明顯降低；同時，赭曲霉菌的生長受環(huán)境濕度影響顯著，當濕度低于14%時幾乎觀察不到任何生長[34]。Clouvel等研究了葡萄在日均氣溫17.2～22.8℃范圍內(nèi)OTA產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)當溫度低于15℃時，真菌的生長被明顯抑制，OTA的產(chǎn)生也得到有效的控制[35]。Quintela等發(fā)現(xiàn)少雨且高溫地區(qū)的葡萄更容易污染OTA[21]。

葡萄制品的制作工藝對OTA也會產(chǎn)生影響，Valero等發(fā)現(xiàn)通過日曬干燥處理制作出來的葡萄干比其他干燥方式更容易感染OTA；而且，在陰涼干燥的條件下釀造的葡萄酒OTA含量要明顯高于干熱條件下釀造的葡萄酒，可能因為前者需要干燥時間太長（2～6個月）而極易滋生霉菌，從而導致了OTA的產(chǎn)生[23]。

此外，在葡萄成熟的前期、后期，尤其是在葡萄收獲前的20d（可以通過葡萄的含糖量來判斷）以及過熟的葡萄上，炭黑曲霉最易侵染葡萄而產(chǎn)生OTA，因此，在葡萄成熟期一直到葡萄收獲、運輸整個過程都應引起人們的重視[35-37]。

3 葡萄及其制品中OTA的清除

3.1 物理方法

橡木塞是葡萄酒釀造過程中必備的物質(zhì)，Savino等發(fā)現(xiàn)其能去除紅葡萄酒中的OTA，而且橡木粉末效果最好[38]。研究表明，葡萄酒釀造過程中使用的許多下膠材料也能夠有效吸附葡萄酒中的OTA，其中活性炭在紅葡萄酒中的吸附率可達到44.2%～100%，當其劑量為0.24g/L時，去除OTA效果最好；酪酸鉀也能達到85%，與之相比，膨潤土僅能吸附11.1%～23.7%的OTA；但是在白葡萄酒中，相對其他澄清劑，膨潤土具有較好的吸附效果[39-41]。此外，Solfrizzo等發(fā)現(xiàn)使用沒有污染OTA的葡萄渣，與含有OTA的葡萄酒混合處理24h后，除去葡萄渣，能夠清除50%～65%的OTA，而且選用與葡萄酒種類相同的葡萄渣進行處理，更能夠很好的保持葡萄酒的色澤以及營養(yǎng)價值[42]。

輻照是一種簡單、易操作的方法，遲蕾等研究發(fā)現(xiàn)60Coγ射線輻照水溶液的OTA，在4kGy的輻照劑量下，OTA降解率達到90%[43]，但對于能否降解葡萄及其制品中的OTA還需進一步的研究。

3.2 化學方法

化學方法因其具有的高效性，已經(jīng)普遍應用于實踐中，如多菌靈（Carbendazi）和咯菌腈（Fludioxonil）已用于抑制葡萄園中多種霉菌的生長。有研究發(fā)現(xiàn)，多菌靈、嘧菌酯（Azoxystrobin）、敵螨普（Dinocap）與硫磺的結(jié)合處理還能有效的降低葡萄酒中OTA的含量[27，44]。Belli等發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期以及成熟前21d，混合使用37.5%的嘧菌環(huán)胺（Cyprodinil）和25%咯菌腈，對葡萄中的黑曲霉抑制效果最好[45]。然而，Medina等發(fā)現(xiàn)多菌靈雖然能抑制多種霉菌，但是對炭黑曲霉的抑制作用很小，而且會增強炭黑曲霉產(chǎn)生OTA，這再次引起了人們對化學殺菌劑的質(zhì)疑[44]?？傊?，化學殺菌劑在應用上的安全性應該引起人們的注意，不僅需要嚴格控制其在規(guī)定的限量之內(nèi)，而且亟需開發(fā)一種無毒、無害、環(huán)保的化學品，同時還需進一步研究化學殺菌劑是否會產(chǎn)生其他的一些負面效果。

3.3 生物學方法

3.3.1 葡萄酒釀造過程OTA的降解 國外許多學者對葡萄酒釀造過程中OTA的變化情況進行了研究，證明這一過程對降解OTA起了重要的作用。由于地域環(huán)境以及葡萄品種的差異，使得研究結(jié)果也略有差別。其中Cecchini等研究發(fā)現(xiàn)白酒在發(fā)酵過程中，OTA會有46.83%～52.16%的降解，而OTA在紅酒中的降解率為53.21%～70.13%[46]；Ponsone等模擬了葡萄酒的發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)這期間有86.5%的OTA降解；Lasram等也發(fā)現(xiàn)紅酒在罐裝儲存過程中會有55%的OTA降解[47-48]；Fernandes等在研究了葡萄牙綠酒（Vinho Verde）在酒精發(fā)酵過程中OTA的變化時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過蘋果酸乳酸發(fā)酵后，OTA殘留量僅為8%，而且酒渣里面的OTA含量比酒體溶液初始OTA的濃度高，因此推測可能是在去除發(fā)酵沉淀物的過程中去除了部分OTA[49]；Anli等研究了葡萄酒經(jīng)過后發(fā)酵OTA含量的變化，發(fā)現(xiàn)6個月的短期陳釀對OTA含量基本沒有影響，至少需經(jīng)過18個月的陳釀，OTA降解率才達到最大，約為17.6%[50]?？傊?，陳釀還不能完全去除OTA，部分葡萄制品中OTA含量還是超標的，而且，陳釀過程中多數(shù)OTA大部分是因為吸附作用殘存在固體果渣和生物體中，對環(huán)境、人類仍然存在潛在的危害，因此還需要其他措施加以清除。

3.3.2 微生物降解 生物降解OTA是一種相對安全、環(huán)保的方法，成為替代化學品的最佳選擇，目前被認為是最具有前景的方法。近年來，生物降解OTA逐漸引起人們的重視，國內(nèi)外大量文獻報道了微生物在水溶液中去除OTA的能力。有研究發(fā)現(xiàn)，部分釀酒酵母對OTA也有降解作用，這就為其降解葡萄酒中的OTA提供了便利，使得可行性更高[51]。普魯蘭類酵母不僅能夠控制有效的抑制炭黑曲霉在葡萄上的生長，同時能夠降解OTA[52]。Caridi等研究了20種酵母對葡萄酒中OTA的降解效果，在25℃下經(jīng)過90d的發(fā)酵后，葡萄酒中OTA的降解率為39.9%～92.1%，而發(fā)酵殘渣里面的含有較高量的OTA，由此推斷可能是酵母細胞壁的生甘露糖蛋白對OTA的吸附作用；并通過對比兩株釀酒酵母和它們的46個子代酵母對OTA的吸附作用的大小，發(fā)現(xiàn)實驗所用釀酒酵母對OTA的吸附作用是由基因控制的，因此是一種可遺傳的性狀，但是子代對OTA的吸附作用表現(xiàn)出了較大的差異[53-54]。Bejaoui等發(fā)現(xiàn)實驗所用的40株黑曲霉對OTA都有降解作用，并在研究了黑曲霉的分生孢子對OTA的吸附作用中，發(fā)現(xiàn)部分黑曲霉表現(xiàn)出了高效的去除OTA的能力，且熱殺死的分生孢子仍然具有去除OTA的作用[55-56]。Turbic等發(fā)現(xiàn)兩株乳酸菌L.rhamnosus GG和L.rhamnosus LC-705，1h就能分別降解47.12%和36.43%的OTA，同時這個過程中咖啡因、維生素B-12和葉酸等降解的很少[57]。

然而，細胞的活性并不一定是去除OTA的重要因素，Mateo等從酒中分離出幾株酒類酒球菌（Oenococcus oeni），將其死細胞和活細胞分別培養(yǎng)在含有OTA的培養(yǎng)基中，14d后OTA降解率均超過60%；Bejaoui等發(fā)現(xiàn)熱殺死的黑曲霉分生孢子仍然具有去除OTA的作用；Var等甚至發(fā)現(xiàn)熱殺死的酵母細胞細胞表現(xiàn)出了更高的吸附OTA的能力[58-59]。

4 結(jié)論

綜觀目前的研究發(fā)現(xiàn)，OTA在葡萄及其制品中的出現(xiàn)極為普遍。然而在我國，對OTA污染狀況調(diào)查相對較少，同時，葡萄及其制品還沒有相應的OTA限量標準，因此亟需建立相關的風險監(jiān)控體系。此外，為了盡可能減少OTA對人類的危害及環(huán)境的污染，還需進一步的研究降解OTA的方法。隨著人們對食品安全意識的提高，化學方法處理的食品引起人們的高度警惕，而生物方法結(jié)合適當?shù)奈锢矸椒ㄈコ齇TA，克服了化學法帶來的安全隱患問題，因此開發(fā)一種高效、安全、環(huán)保的生物制劑降解OTA具有廣闊的應用前景。

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