超聲微波協(xié)同提取甘薯葉中黃酮類化合物的研究

劉漢文，陳洪興，龔曉鈺

（鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城224051）

甘薯屬于旋花科甘薯屬甘薯種草本植物，我國常年種植面積在6.7×106hm2以上[1]，是廣泛栽培的四大作物之一。一直以來，人們利用的只是甘薯的塊根，對于甘薯葉，除作飼料或部分食用外，大多數(shù)被拋棄于田埂，造成了資源的極大浪費。甘薯葉的營養(yǎng)價值比甘薯高，其蛋白質和脂肪含量尤其是無機鹽含量很高，胡蘿卜素、VB1、VB2、VC比其他常見蔬菜含量高。甘薯葉抗癌、抗氧化作用比常見蔬菜強。向仁德等[2]從引種的巴西甘薯葉的乙醇提取物中，柱層析得到8個化合物，其中5個已經確認為黃酮類化合物，分別為檞皮苷、山奈素-4’，7-二甲醚、商陸黃素、檞皮素、檞皮素-3’，4’，7’-三甲醚。譚桂山等[3]也從引種的巴西甘薯葉中分離出檞皮素。鄒耀洪[4]從國產甘薯葉中分離出4種黃酮類化合物，并鑒定其為檞皮素、檞皮素-3-O-β-D-葡萄糖-（1，6）-a-L-鼠李糖苷、4’，7-二甲氧基山奈酚、檞皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。目前，從甘薯葉中提取黃酮類化合物的方法主要有有機溶劑提取法、超聲波提取法、微波法提取等。朱紅等[5]以50%乙醇作為提取劑，料液比1∶30，溫度為70℃，回流提取2h，得到甘薯葉中黃酮類化合物的提取率為5.87%；王玫等[6]利用超聲波法提取甘薯葉黃酮，得到甘薯葉黃酮提取率為8.22%。本實驗報道用超聲振動與微波兩種作用方式相結合輔助溶劑提取甘薯黃酮類化合物，利用超聲波振動的空化作用以及微波的高能作用，實現(xiàn)低溫常壓的條件下，黃酮類化合物的溶劑提取，避免破壞所提取的有機物分子的結構，并采用聚酰胺柱層析法分離了黃酮類化合物中的檞皮素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘薯葉 蘇薯8號；蘆丁標準品純度≥98%、槲皮素標準品純度≥98% 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯、聚酰胺、氯仿、甲醇、硅膠、羧甲基纖維素鈉 均為AR。

XA-1粉碎機 江蘇金壇億通電子有限公司；AY-220電子分析天平日本Shimadzu公司；CS101-2E電熱恒溫干燥箱 上海時達實驗儀器有限公司；SHZ-IIIB循環(huán)水真空泵 上海儀表（集團）銷售公司；UV-9100紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；RE52CS旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；XO-SM 50超聲微波組合反應系統(tǒng) 南京先歐生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 準確稱取經105℃干燥至恒重的蘆丁標準品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100m L，配成150μg/m L的蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00m L，相當于蘆丁0、75、150、300、450、600μg移入25m L試管中，加入30%乙醇液至5m L，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3m L，振搖后放置5m in，加入10%亞硝酸鋁溶液0.3m L搖勻后放置6m in，加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液2m L，用30%乙醇定容至10m L，以以第一管為空白調零，搖勻后用1cm的比色杯，在510nm處測定吸光度[7]。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 甘薯葉黃酮類化合物的提取工藝流程 甘薯葉→清洗→風干→粉碎→過篩（60目）→烘干至恒重→乙醇溶劑預浸→超聲微波協(xié)同提取→抽濾→濃縮→測吸光度→計算提取率。

準確稱取1g烘干至恒重的甘薯葉粉末，加入一定量一定濃度的乙醇，預浸提1h，進行超聲-微波協(xié)同萃取。將抽濾得到的濾液轉入100m L容量瓶中，加水定容到100m L。精確吸取2m L定容后的溶液加入30%乙醇液至5m L，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3m L，振搖后放置5m in，再加入10%亞硝酸鋁溶液0.3m L搖勻后放置6min，加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液2m L，最后用30%乙醇定容至10m L，測定其吸光度。

式中：x—以蘆丁為參照計算甘薯葉中黃酮類化合物的提取率；y—提取溶液的吸光度。

1.2.2.1 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 在料液比1∶50、超聲功率300W、超聲時間3m in、微波功率100W、微波時間3min條件下，分別考察50%、60%、70%、80%、90%乙醇體積分數(shù)對甘薯葉黃酮化合物提取率的影響。

1.2.2.2 料液比對提取率的影響 在乙醇體積分數(shù)80%、超聲功率300W、超聲時間3min、微波功率100W、微波時間3m in條件下，分別考察料液比1∶30、1∶40、1∶50、 1∶60、1∶70對甘薯葉黃酮化合物提取率的影響。

1.2.2.3 超聲功率對提取率的影響 在乙醇體積分數(shù)80%、料液比1∶50、微波功率100W、微波時間3min、超聲時間3m in條件下，分別考察超聲功率100、200、300、400、500W對甘薯葉黃酮化合物提取率的影響。

1.2.2.4 超聲時間對提取率的影響 在乙醇體積分數(shù)80%、料液比1∶50、超聲功率300W、微波功率100W、微波時間3m in條件下，分別考察超聲時間3、6、9、12、15m in對甘薯葉黃酮化合物提取率的影響。

1.2.2.5 微波功率對提取率的影響 在乙醇體積分數(shù)80%、料液比1∶50、超聲功率300W、超聲時間3m in、微波時間3min條件下，分別考察微波功率50、100、150、200、250W對甘薯葉黃酮化合物提取率的影響。

1.2.2.6 正交實驗設計 根據上述實驗，微波功率對甘薯葉黃酮提取率的影響圖線趨勢平緩，說明微波功率的變化對甘薯葉黃酮提取率的影響較小，保持微波功率150W，微波時間長，微波的高能作用會使甘薯葉中的活性成分破壞，選擇微波作用時間3m in，以料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲時間這4個因素進行正交實驗，因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 聚酰胺柱層析柱分離甘薯葉黃酮類化合物

聚酰胺→浸泡→裝柱→加樣→乙醇梯度洗脫→收集→干燥稱重。

準確稱取2.00g上述最佳提取條件提取的黃酮類化合物，用石油醚、乙酸乙酯萃取，去除雜質，用少量乙醇溶解，將樣品液沿管壁慢慢加入至柱頂部，并用少量乙醇把容器和滴管沖洗干凈并全部加入柱內，慢慢打開活塞，調整液面和柱面相平為止，關閉活塞，然后，依次用100m L的蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、無水乙醇進行梯度洗脫。洗脫速度2m L/m in，洗脫下來的物質的質量采用多份收集，旋轉蒸發(fā)器濃縮，每份定性檢測，合并相同組分蒸干。

1.2.4 薄層色譜 將5g硅膠G在攪拌下慢慢加入12m L 0.4%羧甲基纖維素鈉水溶液中，慢慢調成糊狀，倒在潔凈的玻璃片上，用自制涂鋪器進行涂鋪，自然干燥。在105～110℃活化30～60min。用鉛筆在距層析板底端0.5cm處畫一條直線，然后用毛細管吸取上述洗脫液在直線上進行點樣，樣點直徑不超過2mm，選擇氯仿∶甲醇按15∶1，溶劑體積為8m L，上行展開，待展開劑上升至前沿約1cm處取出，迅速在展開劑最前沿處畫一橫線。用吹風機吹干，放入碘缸中顯色。

1.2.5 數(shù)據處理 每個實驗重復3次，結果以SD±s表示。采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析和F檢驗。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

以蘆丁為標準品制作標準曲線來測定總黃酮化合物的含量。蘆丁質量濃度與其吸光度的關系曲線的回歸方程為：y=11.491x+0.0287（R2=0.9913）。式中，y表示吸光度，x表示蘆丁的質量濃度。

2.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

圖1 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.1 The influence of ethyl alcohol concentration on the withdrawing effect

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，溶液的吸光度增加，當濃度達到80%時，溶液的吸光度最大，提取效果最好；繼續(xù)增加乙醇濃度，提取效果反而降低。原因可能是隨著乙醇濃度升高，溶液極性增強，一些醇溶性雜質溶出量增加，這些成分與黃酮類物質競爭同乙醇-水分子結合[8]，導致黃酮的溶解度下降，從而黃酮化合物的提取率下降。

2.3 料液比對甘薯葉黃酮提取率的影響

圖2 料液比對提取效果的影響Fig.2 The influence of proportion ofmaterial to liqiud on the withdrawing effect

由圖2可以看出，隨著溶劑量的增加，甘薯葉黃酮的浸提量增多，料液比1∶50時吸光度達到最高；隨后再增加溶劑量提取效果反呈下降趨勢。原因可能是樣品量一定時，增加溶劑的量可以降低樣品顆粒周圍有效成分的濃度，有利于黃酮由原料向浸提液擴散，增大黃酮浸出率，有利于有效成分的溶出[9]，當溶劑用量增加到一定程度時，原料表面與浸提液之間的濃度差不再是影響黃酮提取效果的主要因素。

2.4 超聲功率對甘薯葉黃酮提取率的影響

圖3 超聲功率對提取效果的影響Fig.3 The influence of ultrasonic power on the withdrawing effect

從圖3可以看出，隨著超聲功率的增加，黃酮的提取效果也隨著增加，當超聲功率達到400W時提取率達到最高，繼續(xù)增加超聲功率吸光度有降低趨勢?？赡艿脑蚴浅暡C械破碎過程是一個物理過程，被浸提的生物活性物質在短時間內性質保持不變，生物活性不減，功率增大提高了破碎速度，縮短了破碎時間，極大地提高提取效果，但當功率過大時，黃酮類物質可能被破壞，使提取率降低。

2.5 超聲時間對甘薯葉黃酮提取率的影響

圖4 超聲時間對提取效果的影響Fig.4 The influence of ultrasonic time on the withdrawing effect

從圖4可以看出隨著超聲時間的增加，黃酮提取率不斷增大，至6m in時，黃酮提取率達到最大。6m in之后，黃酮提取率逐漸下降。這一現(xiàn)象的原因可能是因為超聲波會導致細胞內產生劇烈的渦流擴散，增大細胞內外有效成分的濃度差，從而加快溶質的傳質速率，但隨著超聲波處理時間的延長，黃酮提取率反而下降，可能是其他成分溢出，與黃酮在乙醇溶液中形成競爭，降低了由顆粒內部向周圍溶液的擴散程度[9]。

2.6 微波功率對甘薯葉黃酮提取率的影響

從圖5可以看出，溶液的吸光度隨著微波功率的提高而增加，微波功率在150W時提取率達到最高，當微波功率繼續(xù)提高時，提取效果反而有下降的趨勢。這可能是由于花生殼細胞中的極性分子和溶劑分子在微波作用下發(fā)生高速轉動，隨著功率增加而逐漸增強，促使細胞快速升溫、升壓，迫使細胞壁破裂，使細胞內組分迅速釋放，從而有利于黃酮的提取[10]。但是，當微波功率過大時，其強熱效應可能對有效成分產生破壞作用，導致黃酮含量下降[11]。

圖5 微波功率對提取效果的影響Fig.5 The influence ofmicrowave power on the withdrawing effect

2.7 工藝條件的優(yōu)化與結果分析

表2 L9（34）正交實驗結果Table2 Test results of L34）orthogonal experiment

表2 L9（34）正交實驗結果Table2 Test results of L34）orthogonal experiment

實驗號 A B C D 提取率（%）1 1 1 1 1 5.71 2 1 2 2 2 6.45 3 1 3 3 3 5.12 4 2 1 2 3 5.19 5 2 2 3 1 7.03 6 2 3 1 2 5.66 7 3 1 3 2 5.75 8 3 2 1 3 6.65 9 3 3 2 1 5.62 k1 5.76 5.55 6.01 6.12-k2 5.96 6.71 5.75 5.95-k3 6.01 5.47 5.97 5.65-R 0.25 1.26 0.26 0.47-因素主→次 BDCA優(yōu)水平 A3 B2 C1 D1優(yōu)組合 B2D1C1A3

表3 方差分析結果Table3 The results of variance analysis

由表2正交實驗極差分析可以看出，影響甘薯葉黃酮化合物提取的因素主次為：乙醇濃度＞超聲時間＞超聲功率＞料液比，最優(yōu)組合B2D1C1A3。由表3方差分析結果可知：只有B（乙醇濃度）F值大于F0.05臨界值，乙醇濃度對甘薯葉黃酮提取率具有顯著影響，A因素SS值相對較小，可作為誤差項。由于沒有交互作用，故為加性模型，因而，可直觀判斷有B2D1C1參加的處理表現(xiàn)一定好于其他處理。

由于正交實驗中無此組合，在乙醇濃度80%、料液比1∶60、超聲功率300W、超聲時間3m in、微波功率150W、微波時間3m in條件下，做3次驗證實驗，甘薯葉中黃酮類化合物的提取率為8.61%。表明實驗所確定的工藝條件為最優(yōu)條件。

2.8 甘薯葉黃酮化合物的分離

表4 不同濃度乙醇的洗脫效果Table4 The eluting effectof different concentrations of ethanol

洗脫下來的溶劑用旋轉蒸發(fā)器濃縮點樣見圖6。

圖6 薄層色譜Fig.6 Thin layer chromatography

由圖6可見，糖、氨基酸、非酚類苷、鞣質等一部分物質主要集中在水及30%、50%、60%的乙醇洗脫液中，槲皮素主要集中在70%乙醇洗脫液和95%乙醇洗脫液中，無水乙醇中幾乎沒有槲皮素。因此，如忽略70%乙醇洗脫液和95%乙醇洗脫液中仍存在部分與碘結合的雙鍵物質，通過表4可估算出樣品中槲皮素的含量約為（24.6+7.7）/2000=1.62%。與李志[12]槲皮素含量占甘薯葉的總黃酮含量的1.3%～1.8%相一致。

3 結論

3.1 通過單因素實驗和設計正交實驗，得出超聲-微波協(xié)同乙醇提取甘薯葉中的黃酮類化合物的最佳工藝條件為：乙醇濃度為80%，超聲功率300W，超聲時間3m in，料液比1∶60，微波功率150W，微波時間3m in，甘薯葉中黃酮類化合物的得率為8.61%。

3.2 采用聚酰胺柱色譜分離甘薯葉黃酮類化合物，槲皮素含量在1.62%以下。

3.3 甘薯葉營養(yǎng)成分與生物活性成分使其具有很大的開發(fā)價值，既符合食品科學的研究方向，又與國家惠農發(fā)展政策相一致，其開發(fā)利用必將具有十分廣闊的市場前景。

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