提高靈芝-當(dāng)歸雙向固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)抗氧化活性的條件優(yōu)化研究

魏 龍，贠建民，艾對(duì)元，張紊瑋，丁葉梅，陳 芳

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

中草藥是一類潛力巨大的天然抗氧化劑資源[1]，但由于中草藥發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)成分含量低、不易合成、難以分離，且原料人工培育的成本高、周期長(zhǎng)，無(wú)法保證市場(chǎng)的需求[2]。而利用微生物發(fā)酵的方法可以有效提高中草藥中某一成分的含量或產(chǎn)生一些原中藥材中不具有的活性成分，從而為中藥有效化合物的獲取提供了新的途徑[3]。上世紀(jì)80年代末，莊毅教授提出了藥用真菌雙向固體發(fā)酵的概念[4]。雙向固態(tài)發(fā)酵技術(shù)是指經(jīng)過(guò)篩選的中藥材（藥性基質(zhì)）和營(yíng)養(yǎng)輔料（非藥性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)）組成全性基質(zhì)，接種單株藥用真菌，通過(guò)人工控制溫度、濕度等條件，基質(zhì)在提供真菌生長(zhǎng)所需要營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)又能被真菌的酶改變其組織成分，使藥性基質(zhì)原有化學(xué)成分經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化作用，產(chǎn)生具有新的味性功能的藥性菌質(zhì)或全性菌質(zhì)。它具有反應(yīng)條件溫和、區(qū)域和立體選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、成本較低、公害少等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能夠完成一些常規(guī)炮制方法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)，從而獲得一些結(jié)構(gòu)更合理或活性更好的藥物成分[5]。楊海龍、王林等利用黃芪、當(dāng)歸、黨參、玄參粉末或其水提取物來(lái)培養(yǎng)靈芝，結(jié)果表明，在適宜添加量下，能有效提高靈芝多糖這類抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)生[6-7]。李赟等研究發(fā)現(xiàn)添加適量黨參提取液能顯著促進(jìn)白靈菇胞內(nèi)多糖、胞外多糖得率[8]。阮鳴等探索了黃芪雙向固體發(fā)酵過(guò)程中黃芪甲苷的轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷經(jīng)藥用真菌（靈芝）雙向固體發(fā)酵后發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化，這一轉(zhuǎn)化具有增效作用[9]。喬英、劉建華等研究表明，靈芝（Ganoderma lucidum）具有良好的抗氧化活性[10-11]，臨床上廣泛應(yīng)用于提高免疫力、抗腫瘤、抗癌、鎮(zhèn)痛、保肝、增強(qiáng)記憶、抗菌、消炎等疾病的預(yù)防與治療[12-15]。研究報(bào)道表明，當(dāng)歸（Angelicae sinensis）具有抗腫瘤、抗輻射損傷、增強(qiáng)免疫功能、補(bǔ)血、改善血液循環(huán)等功效[16-17]，而有關(guān)當(dāng)歸發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的研究報(bào)道較少。為此，本實(shí)驗(yàn)擬以甘肅地產(chǎn)當(dāng)歸作為主要藥性基質(zhì)，采用靈芝作為菌種，探索二者進(jìn)行雙向固體發(fā)酵的最適發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)組成和最佳發(fā)酵條件，及其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性的影響，旨在為相關(guān)中藥制劑的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝（Ganoderma lucidum）菌種 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存；當(dāng)歸（Angelicae sinensis） 市售，藥材級(jí)，產(chǎn)自甘肅岷縣；麥麩、玉米芯、玉米淀粉 市售。

VU756CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；THZ-8臺(tái)式恒溫振蕩器 上海佑科儀器儀表有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備 PDA斜面培養(yǎng)基，用于靈芝菌種的活化；搖瓶種子液培養(yǎng)基，采用玉米淀粉液體培養(yǎng)基，組成為：玉米淀粉30g，蔗糖20g，酵母粉5g，MgSO41g，KH2PO41.5g，VB10.1g，水1000m L。非藥性基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：玉米芯32%，麥麩為66%，MgSO40.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO41%，含水量65%。

1.2.2 菌種的活化 靈芝菌苔接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d。待菌絲長(zhǎng)滿斜面，備用。

1.2.3 液體菌種制備 取兩小塊（面積1cm2）活化的斜面菌絲體，接種到裝有100m L液體種子培養(yǎng)基的250m L三角瓶中，28℃、150r/m in培養(yǎng)6d，待用。

1.2.4 最適發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)的確定

1.2.4.1 當(dāng)歸添加量的確定 當(dāng)歸粉末添加量設(shè)置：在1.2.1所述非藥性基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，分別添加0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%當(dāng)歸粉末，控制水量65%。裝入250m L三角瓶中，滅菌后以10m L/100g接種量接種靈芝種子液，在28℃培養(yǎng)7d，測(cè)定其抗氧化活性，確定當(dāng)歸添加量。

1.2.4.2 非藥性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中麥麩與玉米芯比例的確定 在上述已確定的當(dāng)歸添加量基礎(chǔ)上，來(lái)篩選非藥性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中麥麩與玉米芯的比例。麥麩∶玉米芯配比設(shè)置為：1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，其他條件為MgSO40.5%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO41%，含水量65%。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，確定基質(zhì)中麥麩與玉米芯最佳配比。

1.2.5 最佳發(fā)酵條件單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 接種量的確定 在1.2.4優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別接種6、8、10、12、14m L/100g靈芝種子液，28℃培養(yǎng)7d，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性。

1.2.5.2 料層厚度的確定 在250m L三角瓶中分別裝入1.2.4優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)，使料層厚度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0cm，以篩選的最佳接種量接種，28℃培養(yǎng)7d，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性。

1.2.5.3 初始pH的確定 依據(jù)上述優(yōu)選條件，分別設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，28℃培養(yǎng)7d，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，以確定靈芝發(fā)酵當(dāng)歸的最適初始pH。

1.2.5.4 發(fā)酵周期的確定 依據(jù)上述優(yōu)選條件進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，28℃培養(yǎng)，分別在第7、9、11、13、15、17、19、21d測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，以確定適宜發(fā)酵周期。

1.2.6 最佳發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)表L9（34）對(duì)發(fā)酵接種量、料層厚度、培養(yǎng)基初始pH和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1），每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)。正交實(shí)驗(yàn)所得發(fā)酵產(chǎn)物以其DPPH自由基清除率為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)結(jié)果的極差和方差分析，確定DPPH自由基清除率高的組合為最佳發(fā)酵條件。

表1 培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Orthogonal designs of culture conditions

1.2.7 抗氧化活性的測(cè)定方法

1.2.7.1 發(fā)酵菌質(zhì)的預(yù)處理 在65℃條件下將發(fā)酵菌質(zhì)烘至恒重，粉碎后過(guò)40目篩，取粉末5g于三角瓶中加100m L水，室溫下超聲提取30m in后，70℃水浴中提取30min，4000r/m in離心10min，收集上清液，定容至100m L，備用[18]。

1.2.7.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參照張匯等[19]抗氧化活性測(cè)定方法。

1.2.7.3 還原力的測(cè)定 參照曾榮耀等的方法[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中當(dāng)歸最適添加量對(duì)抗氧化活性的影響

高濃度的中藥添加量會(huì)抑制真菌的生長(zhǎng)[6]。因此，有必要確定雙向發(fā)酵基質(zhì)中當(dāng)歸的最適添加量。六個(gè)不同供試當(dāng)歸添加量對(duì)雙向固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性及靈芝菌絲體生長(zhǎng)情況的影響分別見(jiàn)圖1和表2。

從圖1可以看出，隨著當(dāng)歸添加量的增加，發(fā)酵菌質(zhì)的DPPH自由基清除能力與還原力均呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)歸添加量為15%時(shí)達(dá)到最大，DPPH自由基清除率為44.6%，OD值達(dá)到0.275，此后下降；且各梯度間差異顯著。從表2可知，添加當(dāng)歸15%時(shí)靈芝菌絲生長(zhǎng)狀況最好，此后隨著當(dāng)歸添加量的增加，靈芝菌絲體長(zhǎng)勢(shì)呈下降趨勢(shì)，可能是由于當(dāng)歸中的某種藥效成分對(duì)靈芝的生長(zhǎng)抑制作用造成的。故綜合以上結(jié)果，選擇15%的當(dāng)歸粉末作為發(fā)酵基質(zhì)的最適添加量。

圖1 不同當(dāng)歸添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 The effectof different A.sinensis adding amounton antioxidantactivity of fermented products

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中麥麩-玉米芯配比對(duì)抗氧化活性的影響

圖2 不同麥麩玉米芯添加比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.2 The effect of differentbran and corncob rate on antioxidantactivity of fermentation products

為確定非藥性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中麥麩與玉米芯比例，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了五個(gè)不同比例來(lái)考察其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性及靈芝菌絲體生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果分別見(jiàn)圖2和表3。

從圖2可以看出隨著發(fā)酵基質(zhì)中玉米芯添加量增大，發(fā)酵菌質(zhì)的DPPH自由基清除率與還原力均隨之升高，麥麩與玉米芯之比為1∶3時(shí)，到達(dá)最大值45.1%，還原力最大為0.276，此后略有下降，且各梯度間差異顯著。從表3可知，在供試條件下，基質(zhì)中玉米芯的添加量越大，靈芝菌絲體生長(zhǎng)狀況越好，綜合以上結(jié)果，選擇1∶3作為麥麩與玉米芯的最適配合比例。

2.3 提高靈芝-當(dāng)歸雙向發(fā)酵基質(zhì)抗氧化活性的最佳發(fā)酵條件篩選

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 最佳接種量篩選 從圖3可以看出，同對(duì)照相比，隨著接種量的增大，發(fā)酵菌質(zhì)的DPPH自由基清除率與還原力均隨之升高，當(dāng)接種量為12m L/100g時(shí)，到達(dá)最大，分別為45.6%、0.284，此后二者無(wú)明顯變化；且差異顯著。從表4可知，隨著接種量的增加，靈芝生長(zhǎng)狀況越好，當(dāng)10%時(shí)達(dá)到最好，之后基本保持不變。但是，結(jié)合發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化活性，綜合以上結(jié)果選擇12%作為發(fā)酵的最佳接種量。

圖3 不同接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 The effectof different inoculum volume on antioxidant activity of fermentation products

表2 不同當(dāng)歸添加量對(duì)靈芝生長(zhǎng)狀況的影響Table2 The effectof different A.sinensis adding amount onmycelium growth status of G.lucidum

表4 不同接種量對(duì)靈芝生長(zhǎng)情況的影響Table4 The effectof different inoculum volume onmycelium growth status of G.lucidum

2.3.1.2 料層厚度篩選 從圖4可以看出，隨著料層厚度增大，發(fā)酵菌質(zhì)的DPPH自由基清除率呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)料層厚度為2.5cm時(shí)，到達(dá)最大為45.4%；在此條件下，還原力也達(dá)到最大，為0.280，且與其他處理間的差異顯著。從表5可知，當(dāng)料層厚度為2.5cm時(shí)靈芝生長(zhǎng)狀況為最好，之后隨著料層厚度的增加靈芝生長(zhǎng)狀況越差，可能是由于培養(yǎng)基中溶氧量減少的原因造成的。結(jié)合發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化活性，綜合以上結(jié)果選擇2.5cm為最佳料層添加厚度。

圖4 不同料層厚度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.4 The effectof differentmaterial thickness on antioxidantactivity of fermentation products

圖5 不同初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.5 The effect of different initial pH on antioxidantactivity of fermentation products

2.3.1.3 最適初始pH篩選 從圖5可以看出，隨著初始pH的量增大，發(fā)酵菌質(zhì)的DPPH自由基清除率和還原力均隨之升高，當(dāng)初始pH為6時(shí)，二者均到達(dá)最大，其中DPPH自由基清除率為45.1%，還原力最大為0.280；此后呈下降趨勢(shì)；且差異顯著。從表6可知，初始pH為6.0時(shí)靈芝生長(zhǎng)狀況達(dá)到最好，在文獻(xiàn)報(bào)道的靈芝最適生長(zhǎng)pH范圍內(nèi)。綜合以上結(jié)果選擇6.0作為發(fā)酵的最佳pH。

2.3.1.4 最佳發(fā)酵時(shí)間篩選 在確定了發(fā)酵接種量、料層厚度、初始pH的條件下，選取不同時(shí)間收獲的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化比較，從而確定最佳發(fā)酵終點(diǎn)。從圖6可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，發(fā)酵菌質(zhì)的抗氧化活性隨之升高，其中，在第15d時(shí)到達(dá)最大，其中，DPPH自由基清除率為：47.16%、還原力為：0.293，此后基本保持不變。故選擇15d為一個(gè)發(fā)酵周期。

圖6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)獲得的發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.6 The effect of different fermentation time on antioxidantactivity of fermentation products

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 基于單因素所得的最佳條件，采用正交表L9（34）安排正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7。

由表7極差分析結(jié)果可知：在實(shí)驗(yàn)取值范圍內(nèi)，影響因素中對(duì)DPPH自由基清除率影響最大的是接種量，其次是料層厚度，再次是初始pH，而影響最小的是發(fā)酵時(shí)間。從極差分析表中得出最優(yōu)組合為：A2B2C1D2，即接種量12%、料層厚度2.5cm、初始pH 5.5、發(fā)酵時(shí)間15d。

為檢驗(yàn)各因素對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)清除DPPH自由基能力的影響程度，采用SPSS Statistics 21軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表8。

通過(guò)表8方差分析可知，接種量和料層厚度對(duì)DPPH自由基清除率有顯著影響；而初始pH與發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)清除DPPH自由基能力的影響不顯著。

表5 不同料層厚度對(duì)靈芝生長(zhǎng)情況的影響Table5 The effectof differentmaterial thickness onmycelium growth status of G.lucidum

表6 不同初始pH對(duì)靈芝生長(zhǎng)情況的影響Table6 The effectof different initial pH onmycelium growth status of G.lucidum

由于在表7正交實(shí)驗(yàn)中得出的最佳發(fā)酵條件為：A2B2C3D1；而在極差分析結(jié)果中得出的最優(yōu)組合為：A2B2C1D2；二者不一致，故需通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，即在接種量12%、料層厚度2.5cm、初始pH5.5、發(fā)酵時(shí)間15d的條件下發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定DPPH自由基清除率，重復(fù)6次，結(jié)果如表9。

表7 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其極差分析Table7 Results of orthogonal experimentand range analysis

表8 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table8 Variance analysis on the results of orthogonal experiment

表9 最優(yōu)組合下發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性Table9 Antioxidantactivity of fermentationmedium in the optimal combination

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表9得出，在最優(yōu)組合即接種量12%、料層厚度2.5cm、初始pH 5.5、發(fā)酵時(shí)間15d的條件下，DPPH自由基清除率平均值為49.03%，還原力（OD）平均值為0.298，高于在正交表組合5中得出的最高抗氧化活性。其還原力比不發(fā)酵基質(zhì)提高了6.26倍。故得出最佳發(fā)酵條件為：接種量12%、料層厚度2.5cm、初始pH 5.5、發(fā)酵時(shí)間15d。

3 討論

有關(guān)靈芝抗氧化活性的研究與應(yīng)用由來(lái)已久[10-11]。靈芝作為中藥材發(fā)酵菌種已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，以往研究報(bào)道表明，靈芝發(fā)酵是提高中藥抗氧化活性的良好途徑，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化水平主要取決于菌株的遺傳特性和培養(yǎng)條件[20]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，采用添加當(dāng)歸粉末與非藥性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)復(fù)配進(jìn)行靈芝固態(tài)發(fā)酵，比不添加當(dāng)歸進(jìn)行發(fā)酵的抗氧化活性明顯增強(qiáng)，這與劉媛、丁重陽(yáng)等添加不同中藥在促進(jìn)靈芝液體深層發(fā)酵方面的研究結(jié)果一致[21]。培養(yǎng)基質(zhì)中的非藥性營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)為靈芝菌絲體的生長(zhǎng)提供了充足的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而添加的中藥材當(dāng)歸是提高真菌抗氧化活性的重要原因，可能是因?yàn)橹兴幃?dāng)歸中的某些成分增強(qiáng)了靈芝菌體抗氧化相關(guān)物質(zhì)的合成代謝途徑；另一方面真菌生理活動(dòng)使藥性基質(zhì)中的有效成分發(fā)生了轉(zhuǎn)變，產(chǎn)生新的抗氧化成分，體現(xiàn)了靈芝-當(dāng)歸雙向發(fā)酵的協(xié)同作用結(jié)果。而有關(guān)發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性提高的機(jī)理，尚有待于從生理、生化及代謝產(chǎn)物等方面進(jìn)一步研究探明，這將為中藥發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，發(fā)酵基質(zhì)中當(dāng)歸添加量在30%以上時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響靈芝菌絲體的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低其抗氧化活性，不利于中藥的發(fā)酵。這進(jìn)一步證明了發(fā)酵基質(zhì)中中藥添加量不易過(guò)高這一結(jié)論[4，6]，但這不利于該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用。因此，如何在中藥固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中降低非藥性輔料的添加量，并減輕發(fā)酵過(guò)程中藥性成分對(duì)菌絲體抑制作用等問(wèn)題，還有待于從藥物化學(xué)方面深入研究。

4 結(jié)論

4.1 靈芝-當(dāng)歸雙向發(fā)酵的適宜培養(yǎng)基質(zhì)組成為：當(dāng)歸粉末15%、麩皮與玉米芯混合料為83%（麩皮∶玉米芯為1∶3）、MgSO40.5%、（NH4）2SO40.5%、KH2PO41%。

4.2 最佳固態(tài)發(fā)酵條件為：靈芝種子液接種量12m L/100g、料層厚度2.5cm、初始pH 5.5、發(fā)酵時(shí)間15d。在該條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性最高，DPPH自由基清除率為49.03%、還原力比發(fā)酵前提高了6.26倍。

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