苦瓜皂苷提取物微膠囊化緩釋性能及體外對糖苷酶活性影響研究

靳曉明，尤玲玲，馮 超，葛懷娜，劉金福，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384；2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津300384；3.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津300384）

近年來，糖尿病嚴(yán)重威脅著人類的健康，據(jù)估計，世界上大約3.4億人口正在不同程度的遭受糖尿病的困擾，而且預(yù)計到2030年這個數(shù)據(jù)將翻近一倍。最新統(tǒng)計，我國糖尿病患者已高達(dá)1.1億人，防治糖尿病已刻不容緩。對于糖尿病患者，尤其是Ⅱ型病人，餐后高血糖是發(fā)展為糖尿病的先期預(yù)兆，持續(xù)性餐后高血糖甚至可引起血管損害、功能和代謝障礙，產(chǎn)生多種并發(fā)癥[1]。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑作為新型的口服降血糖藥物，廣泛的應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的治療，可有效降低餐后高血糖。目前，市場上的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物，如阿卡波糖等合成產(chǎn)品，雖療效好，但價格較高且有副作用。因此，植物中高效低毒價廉的天然α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制劑就備受人們青睞。研究發(fā)現(xiàn)苦瓜中分離得到的皂苷粗提物對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用[2-4]，可為人們提供一種天然的、安全有效的酶抑制劑類降糖活性物質(zhì)。

常見的苦瓜提取物制備的保健食品，一般是以片劑、膠囊、沖劑等形式供人們食用，活性物質(zhì)在胃腸中短時間內(nèi)集中地被消化、分解、代謝，功效作用的時間較短。本文采用銳孔凝固浴法，以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材，對苦瓜皂苷提取物進(jìn)行包埋，制成微膠囊，并使其具有緩釋效果，以期保護(hù)活性成分，延長在胃腸中作用時間和對分解碳水化合物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性進(jìn)行更有效的抑制，同時，緩解酶抑制劑帶來的副作用，用于保健食品開發(fā)，更好的發(fā)揮其降低餐后血糖的功效。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜 購于天津市王頂?shù)碳t旗農(nóng)貿(mào)市場；對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG） 上海嘉適科學(xué)儀器有限公司；阿卡波糖片（拜糖平） 北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司；α-葡萄糖苷酶 上海滬峰生物科技有限公司；α-淀粉酶 北京索萊寶科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（DNS） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；殼聚糖 威海紫光科技園有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FD-1C型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE-50型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；752型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；METTLER TOLEDO型pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TY-80R型搖床 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；JB-3型定時恒溫磁力攪拌器 上海雷磁儀器廠新涇分廠；TQZ-312型臺式全溫振蕩器 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LGR20-W型離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；Bio-Tek ELX800型全自動酶標(biāo)儀 美國寶特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜皂苷提取物制備 將新鮮苦瓜洗凈去瓤、切片烘干、粉碎過80目篩。稱取100g苦瓜果實干粉，加60%的乙醇1500m L，在70℃反復(fù)提取三次，每次2h。提取液過濾后濃縮至無醇味，得苦瓜皂苷粗提液，將粗提液真空冷凍干燥成粉狀備用[5]，測定其中皂苷含量[6]。

1.2.2 微膠囊的制作 稱取適量苦瓜皂苷提取物干粉和一定量的海藻酸鈉溶于50m L蒸餾水中，攪拌均勻，45℃水浴中加熱；以100m L的1%的乙酸溶液溶解一定量的殼聚糖和氯化鈣，充分?jǐn)嚢瑁琋aOH調(diào)節(jié)pH至5.5。用5m L的注射器吸取苦瓜提取物干粉海藻酸鈉溶液，緩慢滴入在搖床上振蕩的殼聚糖-氯化鈣溶液中，靜置15m in，流水洗去微球表面的苦瓜粗提物干粉，收集微球，60℃干燥12h，得直徑小于1mm的微膠囊。

1.2.3 微膠囊載藥量和包埋率測定 精確稱取微膠囊0.2g，研細(xì)，充分溶于3m L甲醇中，4000r/m in離心5min，取上清液，于468nm的波長下測定總皂苷含量。按下式計算載藥（總皂苷）量和包埋（總皂苷）率。

式中：C為所測樣品中固形物的質(zhì)量濃度；W為微球質(zhì)量；G為0.2g微球中原始添加芯材質(zhì)量；DL為微球載藥量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；ER為微球包埋率[7]。

1.2.4 體外釋放實驗 將2g已干燥的微膠囊樣品加入100m L模擬胃液（pH1.2的鹽酸溶液）中，37℃恒溫振蕩2h，然后將樣品轉(zhuǎn)入100m L的模擬腸液（pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液）中作用10h。并在指定時間1、2、4、6、8、10、12h分別取1m L的樣液，同時補充等量的等溫介質(zhì)。所取樣液4000r/min離心5min，取上清液測定其中皂苷含量，用相同質(zhì)量的空白微膠囊作對照，方法同上。由下式求得各時間點的苦瓜提取物皂苷的累積釋放率Q。

式中：Cn為第n個時間點所取樣品中固形物的質(zhì)量濃度；V為釋放介質(zhì)總體積；Vi為第i個時間點的取樣體積；Ci為第i個時間點所取樣品質(zhì)量濃度；W為微球總質(zhì)量；DL為微球載藥量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.5 模擬胃腸環(huán)境對α-葡萄糖苷酶活性的影響對α-葡萄糖苷酶抑制的測定在Jutta Eichler等[8]的基礎(chǔ)上稍做修改，采用九十六孔板法，用微量移液器向每孔中準(zhǔn)確加入樣液50μL，pH 6.8緩沖液50μL，0.2U/m L α-葡萄糖苷酶液50μL，室溫孵育20m in后，加入50μL 1.5mg/m L對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG），37℃孵育30m in，2500r/m in離心3m in，取100μL上清液，405nm測定吸光度值。蒸餾水替代樣液和緩沖液替代酶液作為空白組，蒸餾水替代樣液作為控制組。樣液為將2g已干燥的微膠囊，0.75g苦瓜提取物干粉及藥物拜糖平，分別加入100m L模擬胃液中，37℃，50r/min，恒溫振蕩2.5h，在0、0.5、1、1.5、2、2.5h分別取1m L的樣液，同時補充等量的等溫介質(zhì)。所取樣液4000r/m in離心5m in，取上清液作為樣液測定對α-葡萄糖苷酶的抑制，由于苦瓜皂苷本身有顏色，所以每個樣品測定背景吸收，對結(jié)果進(jìn)行校正，按下式計算抑制率。微膠囊放入模擬腸液，方法同上，選取0、2、4、6、8、10h時間點取樣。

1.2.6 模擬胃腸環(huán)境對α-淀粉酶活性的影響 對α-淀粉酶抑制的測定在Zhang等[9]的基礎(chǔ)上稍做修改，取0.5m L樣液加入0.5m L 0.5mg/m Lα-淀粉酶液，25℃溫育10m in，再加入0.5m L 0.5%的淀粉溶液，準(zhǔn)確反應(yīng)5m in后，加入1m L 3，5-二硝基水楊酸（DNS），90℃水浴10min，冷卻到室溫，蒸餾水定容至25m L，540nm測定吸光度值。蒸餾水替代樣液作為空白對照。樣液的獲得同1.2.5所述。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜皂苷提取物微膠囊的體外緩釋效果

在前期研究所得的最優(yōu)條件（海藻酸鈉濃度5%、殼聚糖濃度0.5%、氯化鈣濃度3.5%、海藻酸鈉與芯材的質(zhì)量比0.6∶1）下制備微膠囊，將其在模擬胃液和腸液中進(jìn)行體外釋放實驗，以釋放時間為橫坐標(biāo)，累積釋放率為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果見圖1。

圖1 微膠囊中苦瓜皂苷體外釋放曲線Fig.1 Release profiles ofMomordica charantia saponins microcapsule in vitro

由圖1可知，微膠囊中苦瓜皂苷在模擬胃液中1h釋放率達(dá)到31.19%，2h累積達(dá)到52.14%，說明在酸性條件下，微膠囊的壁材殼聚糖和海藻酸鈉形成的包膜，易遭到破壞，導(dǎo)致芯材釋放。當(dāng)從胃液移入腸液后，苦瓜皂苷釋放緩慢，10h達(dá)到81.20%，可見，所制備的微膠囊在模擬的胃液和腸液中具有良好的緩釋性能，這一結(jié)果與參考文獻(xiàn)一致[10]。分析原因是由于海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊具有一定的耐酸性和腸溶性，可以對包埋物進(jìn)行控制釋放[11]，其可能的機(jī)制是海藻酸鈉與氯化鈣發(fā)生反應(yīng)生成圓形海藻酸鈣骨架，同時將藥物包裹其中；另外，海藻酸鈉還可與殼聚糖的醋酸鹽形成聚離子復(fù)合物填塞骨架網(wǎng)眼，使藥物釋放受到阻礙[12]。這樣苦瓜提取物微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中緩慢溶脹并溶蝕，皂苷類等物質(zhì)通過溶解擴(kuò)散及微膠囊的溶蝕而釋放。

2.2 模擬胃腸環(huán)境對α-葡萄糖苷酶抑制作用

實驗中按照微膠囊的包埋率計算，微膠囊中藥物全部釋放后苦瓜提取物干粉濃度約為7.1mg/m L，對照組苦瓜皂苷提取物干粉在胃腸環(huán)境中的初始濃度為7.5mg/m L。分別在模擬胃腸環(huán)境中微膠囊及對照組對α-葡萄糖苷酶活性的影響如圖2、圖3所示。

由圖2、圖3可知，苦瓜皂苷提取物微膠囊在模擬胃腸環(huán)境中對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，而且隨著皂苷釋放量的增加，抑制率呈上升趨勢，在模擬胃環(huán)境中微膠囊釋放皂苷1h，抑制率為61.57%，2h可達(dá)到80%以上；在模擬腸環(huán)境中2h，抑制率為51.35%，4h達(dá)到68.92%，8h后仍然具有抑制作用，累計抑制率為80.24%。與之相反，未包埋的苦瓜皂苷提取物和拜糖平藥物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨時間推移在模擬胃腸環(huán)境中有逐漸下降的趨勢，胃中2h后抑制率分別下降了27.07%和28.34%，腸中6h后抑制率分別下降了6.77%和2.37%。從α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用機(jī)理看，它是通過與小腸粘膜刷狀緣的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結(jié)合，競爭性抑制其相對活性，使葡萄糖的吸收減緩，吸收時間后延，從而降低餐后高血糖[13-14]，其發(fā)揮作用的場所主要在腸道中。從圖2、圖3中可以得出，苦瓜皂苷提取物通過微膠囊化包埋后，對有效成分起到了一定的保護(hù)作用，最大限度的減少了苦瓜皂苷活性成分在胃液中的破壞，從而使更多的活性成分進(jìn)入到腸道中發(fā)揮效力。臨床上，服用拜糖平后，大量碳水化合物在小腸內(nèi)吸收受阻，進(jìn)入大腸后碳水化合物酵解增加，產(chǎn)氣增多，常會引起腸鳴，腹脹，惡心，嘔吐，食欲減退，甚至導(dǎo)致胃腸痙攣性疼痛、頑固性便秘等不良反應(yīng)。圖3顯示，隨著時間的推移，在腸環(huán)境中微膠囊由于具有緩釋效果而不斷釋放皂苷等物質(zhì)，持續(xù)的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。通過包埋可以有效的緩解大量藥物進(jìn)入腸道后集中釋放可能帶來的副作用。

圖2 模擬胃環(huán)境對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.2 Alpha glycosidase enzyme activity effect in mimic gastric environment

圖3 模擬腸環(huán)境對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.3 Alpha glycosidase enzyme activity effect in mimic intestinal environment

2.3 模擬胃腸環(huán)境對α-淀粉酶抑制作用

在模擬胃腸環(huán)境中微膠囊及對照組對α-淀粉酶活性的影響如圖4、圖5所示。

由圖4、圖5可知，微膠囊對α-淀粉酶有一定的抑制作用，而且隨著在胃腸中的皂苷釋放量的增加，抑制率均有上升趨勢，且都是剛開始抑制率增長速率較快，隨著時間的推移，抑制率增長速率減慢，相反的，未包埋的苦瓜皂苷提取物和藥物拜糖平對α-淀粉酶的抑制作用隨時間推移都有所降低。在模擬胃環(huán)境中微膠囊釋放皂苷0.5h，抑制率為28.67%，2h后達(dá)到40%以上；在模擬腸環(huán)境中微膠囊釋放皂苷2h，抑制率為18.69%，8h后累計抑制率為24.52%。α-淀粉酶是通過與酶形成酶抑制劑復(fù)合物，使酶失活，從而延緩或阻礙了碳水化合物在腸道內(nèi)的消化和吸收，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂水平，從而有效的防止餐后高血糖的發(fā)生[15-16]。同樣的，從圖4、圖5我們可以看出，通過對苦瓜皂苷提取物進(jìn)行包埋，隨著時間的推移，對α-淀粉酶抑制率不斷提高，起到了對功效成分的保護(hù)作用，同時可以控制釋放，延長了天然產(chǎn)物活性成分的作用時間，可減少食用次數(shù)，提高其利用率，并減少副作用。

圖4 模擬胃環(huán)境對α-淀粉酶活性影響Fig.4 Alpha amylase activity effect in mimic gastric environment

圖5 模擬腸環(huán)境對α-淀粉酶活性影響Fig.5 Alpha amylase activity effect in mimic intestinal environment

3 結(jié)論

本實驗以殼聚糖，海藻酸鈉為壁材，對苦瓜提取物進(jìn)行了包埋，在前期研究得出最佳的制備工藝條件下制得的苦瓜提取物微膠囊，在模擬胃液中2h，苦瓜提取物皂苷累積釋放率為52.14%，再在腸液中釋放10h，累積釋放率達(dá)81.2%，表明微膠囊緩釋性能良好。而且微膠囊在胃腸中緩慢釋放，均顯示對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有一定的抑制作用，抑制率隨著釋放量的增加有上升趨勢，相比較未包埋的苦瓜提取物和拜糖平，微膠囊化起到了保護(hù)活性成分、延長作用時間、提高藥物利用率和緩解副作用等效果。該研究為開發(fā)具有輔助降血糖功效的功能食品提供了參考。

[1]張麗.滇丁香、茜草抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[D].開封：河南大學(xué)，2010.

[2]田力東，張名位，郭祀遠(yuǎn)，等.不同苦瓜品種的皂苷含量及對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的比較[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（10）：3415-3421.

[3]Matsuur H，Asakawa C，Kurimoto M，etal.Alpha-glucosidase inhibitor from the seeds of balsam pear（Momordica charantia）and the fruit bodies of Grifola frondosa[J].Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2002，66（7）：1576-1578.

[4]王琪，鄧媛元，張名位，等.苦瓜皂苷和多糖的連續(xù)提取工藝及其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（19）：4058-4065.

[5]張衛(wèi)軍.苦瓜皂甙的分離純化及其指紋圖譜的建立[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6]張玉嬋，劉金福，張平平，等.苦瓜莖、葉中皂苷類物質(zhì)的提取及分離純化[J].食品研究與開發(fā)，2010，31（4）：53-56.

[7]孟慶廷，陳萬東.殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊的制備及緩釋性能研究[J].食品科學(xué)，2010，31（20）：137-140.

[8]Jutta Eichler，Adam W.Lucka，Clemencia Pinilla.Novelαglucosidase inhibitors identified using multiple cyclic peptide combinatorial libraries[J].Molecular Diversity，1996，1：233-240.

[9]Lei Zhang，Shelly Hogan，Jianrong Li，etal.Grape skin extract inhibits mammalian intestinal a-glucosidase activity and suppresses postprandialglycemic response in streptozocin-treated mice[J].Food Chemistry，2010，126（2）：466-471.

[10]李沙，侯新樸.海藻酸鈉-殼聚糖微囊成型機(jī)理及其對大分子藥物的載藥、釋藥研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2003，38（5）：380-383.

[11]何榮軍，楊爽，孫培龍，等.海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊的制備及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2010，26（2）：166-168.

[12]盧鳳琦，曹宇順，趙焰，等.殼聚糖-海藻酸鈉鹽微囊對藥物的緩釋作用[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，27（6）：247-249.

[13]曾嵐.甘草中α-葡萄糖苷酶抑制物質(zhì)的提取、純化和結(jié)構(gòu)研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[14]鄭曉媛.虎杖提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究[D].成都：四川大學(xué)，2007.

[15]黃紹華，胡曉波，王震宙.山藥多糖對淀粉酶活力的抑制作用[J].食品工業(yè)科技，2006，27（9）：94-95.

[16]劉自琴，黃惠華.綠茶和紅茶浸提液對α-淀粉酶的抑制作用研究[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26（7）：680-681.