不同條件下副溶血弧菌生物膜形成規(guī)律及其天然抑制物質(zhì)的研究

郭 欽，徐海棠，楊龍平，蘇春燕，葛占兵

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

副溶血弧菌是海產(chǎn)品主要致病菌之一，能引起魚蝦貝類等多種養(yǎng)殖水產(chǎn)品的疾病，攝入污染了副溶血弧菌的生的或沒有完全煮熟的食物易引起以頭痛、嘔吐、急性腹瀉和低燒為癥狀的急性腸胃炎和敗血癥[1]。一般可采用抗生素類進(jìn)行治療。但研究表明，很多副溶血弧菌具有廣譜耐藥性，對(duì)阿莫西林等抗生素的平均耐藥率高于50%[2]，對(duì)其他青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、頭孢類藥物也有不同程度的耐藥性[3]。

副溶血弧菌的耐藥性與多種因素如基因突變、質(zhì)粒傳導(dǎo)抗性基因以及生物膜相關(guān)。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌以生物膜形式存在時(shí)，耐藥性可增加10～1000倍[4]。副溶血弧菌能夠在固體基質(zhì)的表面附著生長(zhǎng)形成生物膜，這種結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落主要由其分泌的胞外多糖或蛋白包裹細(xì)菌細(xì)胞所組成，對(duì)不良環(huán)境和各種抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗性。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌生物膜的形成受到很多因素的影響，如血清及組織液成分、容量感應(yīng)、細(xì)胞表面成分、生物膜抵抗免疫系統(tǒng)的作用以及培養(yǎng)條件等。目前，很多細(xì)菌如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、隱球菌等形成的生物膜已經(jīng)被大量研究，但關(guān)于副溶血弧菌生物膜形成特性以及抑制物質(zhì)的研究報(bào)道較少。

本文主要研究致病性和非致病性副溶血弧菌在不同培養(yǎng)條件下生物膜的形成規(guī)律及幾種天然物質(zhì)對(duì)其生物膜的抑制作用，為揭示副溶血弧菌的致病機(jī)理和預(yù)防食物中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血弧菌tdh+毒力菌株VP-41和非毒力菌株VP-Y12、VP-S17、VP-S5、VP-S12 本實(shí)驗(yàn)室保存；trh+毒力菌株VP-ATCC17802 中國(guó)普通微生物菌種保藏中心；胰蛋白胨、瓊脂粉、SDS、大豆蛋白胨、NaCl上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；茶多酚、大蒜提取物、生姜提取物 南京化學(xué)試劑有限公司；TCBS瓊脂、腦心浸液瓊脂BHI、氯化鈉三糖鐵瓊脂TSI 青島海博生物技術(shù)有限公司。

超凈工作臺(tái) 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平 上海精科天平儀器廠；MLS-3020CH型立式全自動(dòng)高壓滅菌鍋日本三洋電機(jī)；UV-9600型分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器有限公司；SHA-B型水浴恒溫振蕩器 金壇市中大儀器廠；pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基（3%TSA）：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 30g，溶解于1000m L水中，調(diào)pH 7.2～7.4，121℃滅菌15m in。1%氯化鈉胰蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基（1% TSA）：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 10g，溶解于1000m L水中，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4，121℃滅菌15m in。

1.2.2 副溶血弧菌的活化培養(yǎng) 從TSI斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體，轉(zhuǎn)接入5m L 3%TSA試管中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～16h，再移取200μL培養(yǎng)菌液到裝有新鮮5m L 3%TSA培養(yǎng)液試管中，培養(yǎng)12～16h。

1.2.3 副溶血弧菌生物膜的檢測(cè)[5]稱取0.1g結(jié)晶紫加入到100m L的蒸餾水中，混合均勻。在不同時(shí)間段取出樣品板，輕輕去掉樣品孔中的TSA培養(yǎng)液，保留表面生長(zhǎng)的生物膜，用蒸餾水沖洗3次，置于60℃干燥箱中干燥至恒重，干燥后的生物膜用0.1%的結(jié)晶紫染色5m in，再用蒸餾水沖洗直至洗脫液為無色透明，加入3m L 95%乙醇脫色5min，稀釋脫色液到合適的濃度，用分光光度計(jì)檢測(cè)OD590值。

1.2.4 不同條件下副溶血弧菌生物膜的形成和取樣

1.2.4.1 不同溫度對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響移取活化好的不同副溶血弧菌200μL分別轉(zhuǎn)接至加有5m L TSA培養(yǎng)液的12孔板中，放入37℃和25℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，分別于0、24、48、72、96h進(jìn)行取樣，按照方法1.2.3檢測(cè)生物膜含量。每組設(shè)置三個(gè)平行。

1.2.4.2 不同鹽度對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響移取活化好的不同副溶血弧菌200μL分別轉(zhuǎn)接至加有5m L TSA培養(yǎng)液的12孔板中，每塊12孔板一半裝有1%TSA培養(yǎng)液，一半裝有3%TSA培養(yǎng)液。分別于0、24、48、72、96h進(jìn)行取樣，按照方法1.2.3檢測(cè)生物膜含量。每組設(shè)置三個(gè)平行。

1.2.5 天然產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 天然產(chǎn)物的制備 茶多酚濃縮液：0.15g茶多酚于5m L蒸餾水中，混合均勻后121℃滅菌15min；大蒜提取物濃縮液（98%大蒜素）：0.05g大蒜提取物溶于5m L蒸餾水中，混合均勻后121℃滅菌15m in；生姜提取物濃縮液（5%姜辣素）：1g生姜提取物溶于5m L蒸餾水中，混合均勻后121℃滅菌15m in。

1.2.5.2 抑制實(shí)驗(yàn) 取28支試管分成4組，分別加入5m L 3%TSA培養(yǎng)液，121℃滅菌15m in，然后接入200μL活化好的副溶血弧菌菌液并混合均勻，每組1支試管為空白對(duì)照，其他6支試管分別加入不同濃度的上述四種天然產(chǎn)物（表1），將試管在37℃培養(yǎng)到副溶血弧菌生物膜形成最高的時(shí)間，OD590下測(cè)量各試管生物膜的值。

表1 不同抑制物質(zhì)的終濃度Table1 The different concentrations of inhibitory substances

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌生物膜的形成規(guī)律研究

2.1.1 不同副溶血弧菌形成生物膜的情況 在12孔板中，6株副溶血弧菌基本都能形成生物膜，但形成能力各不相同。其中形成生物膜能力最強(qiáng)的為VPS17（圖1），其可以在液體培養(yǎng)基表明形成一層較為完整的生物膜；最差的是trh+陽性菌株VP-ATCC17802，在25℃和1%鹽濃度下前期基本不形成生物膜；其他菌株皆有不同形成生物膜的能力。

圖1 不同條件下副溶血弧菌培養(yǎng)48h形成的生物膜Fig.1 The biofilm of Vibrio parahaemolyticus in different conditions after 48h cultivation

在培養(yǎng)過程中觀察發(fā)現(xiàn)，1%鹽濃度的TSA培養(yǎng)液中，副溶血弧菌產(chǎn)生的生物膜會(huì)沉淀到培養(yǎng)液的底部，而3%鹽濃度的TSA培養(yǎng)液中，只在培養(yǎng)后期（96h后）才會(huì)出現(xiàn)部分生物膜開始沉淀的現(xiàn)象。生物膜的過程包括形成、成熟和老化三個(gè)階段[5]。使用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察多種細(xì)菌生物膜形成過程發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)由單層細(xì)胞逐步向多層致密細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)展，最底層為舊細(xì)胞，往上為新生細(xì)胞，生物膜各層同一部位的細(xì)胞間存在多處間隙，為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的流入/流出提供空間結(jié)構(gòu)[6]。副溶血弧菌是嗜鹽菌，其細(xì)胞壁對(duì)鹽濃度存在依賴性，鈉離子濃度過低易造成細(xì)胞壁破碎，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解[7]。低鹽濃度下氯化鈉較快消耗完畢，生物膜底層細(xì)胞開始衰亡，使其生物膜逐漸老化，最后結(jié)構(gòu)松散開始沉淀，表明鹽濃度通過促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)而間接維護(hù)生物膜的三維結(jié)構(gòu)。

2.1.2 不同溫度和鹽度下副溶血弧菌生物膜的形成規(guī)律 菌株、溫度和鹽度是影響副溶血弧菌生物膜形成的重要因素。分別測(cè)定25℃和37℃、1%和3%鹽濃度下8株不同副溶血弧菌生物膜的形成規(guī)律，結(jié)果如圖2～圖8所示。

2.1.2.1 非致病副溶血弧菌生物膜生長(zhǎng)形成規(guī)律 非致病副溶血弧菌VP-Y12、VP-S17、VP-S5、VP-S12的生物膜形成規(guī)律基本相似（圖2）。不同溫度下VP-S12生物膜皆隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，3%鹽濃度下72h左右生物膜達(dá)到最大，之后開始下降。1%鹽濃度下生物膜生長(zhǎng)較慢，表現(xiàn)為持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。25℃下剛開始3%鹽濃度下VP-S12的生物膜形成量低于1%濃度，48h后才超過。

圖2 不同溫度和鹽度下VP-S12生物膜生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.2 The biofilm growth trend of VP-S12 at different temperatures and salt concentrations

圖3顯示，37℃不同的鹽濃度下，VP-S5的生物膜形成生長(zhǎng)趨勢(shì)基本都呈緩慢上升趨勢(shì)，但3%鹽濃度的生物膜量明顯高于1%鹽濃度。25℃時(shí)，48h前鹽濃度對(duì)生物膜形成影響不大，之后3%鹽濃度的生物膜生長(zhǎng)速度明顯高于1%，并且在96h達(dá)到最大值。

圖3 不同溫度和鹽度下VP-S5生物膜生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.3 The biofilm growth trend of VP-S5 at different temperatures and salt concentrations

圖4可以看出，37℃、3%鹽濃度下，72h之前VPS17生物膜形成量呈快速上升趨勢(shì)，72h以后生物膜的量開始下降；而37℃、1%鹽濃度下生物膜形成量在48h時(shí)達(dá)到最大。25℃下，1%和3%鹽濃度的生物膜形成變化趨勢(shì)和37℃、1%鹽濃度基本一致。

圖4 不同溫度和鹽度下VP-S17生物膜生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.4 The biofilm growth trend of VP-S17 at different temperatures and salt concentrations

圖5表明，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，37℃下3%鹽濃度的VP-Y12生物膜的形成隨時(shí)間迅速增加，72h達(dá)到最高峰，此后快速下降；1%鹽濃度下的生物膜變化則比較平緩。3%鹽濃度生物膜量顯著高于1%鹽濃度產(chǎn)生的生物膜。25℃、3%鹽濃度時(shí)，VP-Y12的生物膜48h前形成速度較慢，48～72h快速增長(zhǎng)，72h達(dá)到最高峰，之后明顯下降；而25℃、1%鹽濃度下的生物膜則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)一直呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)。

圖5 不同溫度和鹽度下VP-Y12生物膜生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.5 Biofilm growth trend of VP-Y12 at different temperatures and salt concentrations

從研究中看出，不同類型副溶血弧菌生物膜對(duì)溫度和鹽度的要求基本一致，在鹽濃度相同的情況下，37℃培養(yǎng)所形成的生物膜含量明顯高于25℃；溫度相同的情況下，3%鹽濃度下副溶血弧菌比1%濃度下培養(yǎng)的菌株形成生物膜能力更強(qiáng)。這說明在滿足副溶血弧菌生長(zhǎng)的前提內(nèi)，溫度和鹽濃度對(duì)副溶血弧菌生物膜的形成有關(guān)鍵作用，高鹽、高溫有助于副溶血弧菌生物膜的形成，這個(gè)結(jié)論和陳珍的研究相似[5]。有研究認(rèn)為，生物膜的形成跟細(xì)菌粘附相關(guān)，生物膜含量隨菌體濃度升高而增加[8]，但本研究發(fā)現(xiàn)，在最適合副溶血弧菌生長(zhǎng)的25℃[9]，其生物膜含量反而低于37℃，這說明菌體濃度只是生物膜形成的關(guān)鍵性因素之一。

2.1.2.2 tdh+副溶血弧菌生物膜生長(zhǎng)形成規(guī)律 副溶血弧菌分為非致病和致病性兩種，致病性副溶血弧菌可以分泌不耐熱溶血毒素（TLH）和耐熱性直接溶血素（TDH）或耐熱性直接溶血素相關(guān)的溶血素（TRH），其中TDH和TRH是引起副溶血弧菌食物中毒的主要原因[10-11]。研究表明，攜帶tdh毒力基因的致病性副溶血弧菌的生物膜形成規(guī)律與非致病菌基本相似。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，VP-41的生物膜含量逐漸增加，37℃、3%鹽濃度下生物膜量72h后開始下降，而1%鹽濃度下48h后就慢慢減少。3%鹽濃度生物膜量明顯大于1%鹽濃度產(chǎn)生的生物膜。25℃、1%鹽濃度時(shí)，VP-41的生物膜48h之前呈現(xiàn)緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，以后開始下降；而3%鹽濃度的生物膜一直呈緩慢上升趨勢(shì)（圖6）。

圖6 不同溫度和鹽度下VP-41生物膜生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.6 Biofilm growth trend of VP-41 at different temperatures and salt concentrations

2.1.2.3 trh+副溶血弧菌生物膜生長(zhǎng)形成規(guī)律 圖7表明，在不同的溫度和鹽度下，VP-ATCC17802在96h內(nèi)生物膜的形成量一直隨時(shí)間增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，且1%鹽濃度下生物膜的形成量明顯低于3%鹽濃度。48h以后生物膜的形成速度快速增加。3%鹽濃度時(shí)，最后37℃比25℃形成的生物膜含量更高。

圖7 不同溫度和鹽度下VP-ATCC17802生物膜生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.7 The Biofilm growth trend of VP-ATCC17802 at different temperatures and salt concentrations

在培養(yǎng)條件相同的情況下，副溶血弧菌trh+菌株和非致病菌株生物膜形成規(guī)律略有區(qū)別。trh+菌株VP-ATCC17802生物膜含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)一直不斷上升，而tdh+菌株VP-41和非致病菌株VP-S5、 VP-S12、VP-S17、VP-Y12在培養(yǎng)48～72h時(shí)生物膜達(dá)到成熟階段，之后開始下降。本研究表明，非致病菌株形成生物膜能力可能要強(qiáng)于致病性菌株，其中原因尚不清楚。攜帶trh和tdh毒力基因的菌株皆具有溶血毒性、腸毒性和細(xì)胞毒性，是食物中毒的主要原因。但最近研究報(bào)道，不攜帶毒力基因的非致病菌株也可以造成急性腸胃炎等食物中毒癥狀，具體致病機(jī)制尚不明朗[12]，推測(cè)可能跟生物膜的形成能力相關(guān)。生物膜形成能力強(qiáng)的菌株耐腸道環(huán)境能力較強(qiáng)，更易在腸道存活和大量繁殖，從而造成急性腸胃炎等中毒癥狀。

2.2 不同的天然產(chǎn)物質(zhì)對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響

很多天然產(chǎn)物都對(duì)副溶血弧菌有一定的殺滅作用，同時(shí)可能對(duì)致病菌生物膜的形成也有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)使用生姜提取物、大蒜提取物和茶多酚測(cè)試其對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響。

2.2.1 大蒜和生姜提取物對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響 選取形成生物膜能力最強(qiáng)的副溶血弧菌VP-S17進(jìn)行研究。圖8可以看出，當(dāng)大蒜和生姜提取物的濃度低于1%時(shí)，隨濃度增加，生物膜生成量迅速下降，大蒜提取物的抑制作用稍高于生姜提取物；之后隨著濃度的增加，生物膜形成量下降速度逐漸趨于平緩，當(dāng)兩者的濃度超過2%后，對(duì)副溶血弧菌生物膜的抑制作用基本不再變化。

圖8 大蒜和生姜提取物對(duì)生物膜生長(zhǎng)的影響Fig.8 The effects of garlic and ginger extracton biofilm growth

大蒜提取物的主要有效成分是大蒜素，可通過降低細(xì)菌的粘附率和產(chǎn)胞外多糖的能力抑制多種微生物生物膜的形成[13-14]。生姜提取物的有效成分為姜黃素，可以在不影響變形鏈球菌生長(zhǎng)的情況下抑制其生物膜的形成[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜和生姜提取物對(duì)副溶血弧菌生物膜的形成也有較強(qiáng)的抑制作用，濃度越高，抑制越明顯。

2.2.2 茶多酚對(duì)副溶血弧菌生物膜形成的影響 茶多酚對(duì)副溶血弧菌生物膜的形成影響較大。圖9表明，當(dāng)茶多酚的濃度低于0.5%時(shí)，TSA培養(yǎng)基內(nèi)液體變渾濁，表明有副溶血弧菌生長(zhǎng)，但并沒有生物膜形成；當(dāng)茶多酚濃度高于0.5%時(shí)，TSA培養(yǎng)基中基本沒有渾濁，而底部出現(xiàn)沉淀。這說明高濃度茶多酚（＞0.5%）也許通過抑制副溶血弧菌的生長(zhǎng)從而抑制生物膜的形成，而低濃度的茶多酚則可能通過其他機(jī)制抑制生物膜的形成，推測(cè)可能主要是其兒茶素類的物質(zhì)干擾細(xì)菌群體感應(yīng)中信號(hào)分子的合成從而影響細(xì)菌成膜能力[16]。

圖9 茶多酚對(duì)生物膜生長(zhǎng)的影響Fig.9 The effectof polyphenols on biofilm’formation

3 討論

研究表明，黑木耳提取物能抑制大腸桿菌生物膜的形成[17]，黃芩和茶樹油能抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成[18-19]。很多天然產(chǎn)物如丁香、桂皮等香辛料以及醋、酒精、茶多酚都能抑制副溶血弧菌的生長(zhǎng)[20-21]，但對(duì)其生物膜形成的影響尚無報(bào)道。本文選擇的3種天然產(chǎn)物大蒜提取物、生姜提取物和茶多酚，其中，茶多酚能有效抑制副溶血弧菌菌體的生長(zhǎng)和生物膜的形成，但具體結(jié)果與其濃度相關(guān)。低濃度的茶多酚（＜0.5%）僅能抑制生物膜的形成，但不影響副溶血弧菌的生長(zhǎng)；高濃度的茶多酚（≥0.5%）則基本抑制了副溶血弧菌的生長(zhǎng)從而抑制了生物膜的形成。大蒜提取物和生姜提取物對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)影響較少，但都能有效抑制其生物膜形成，且抑制作用隨濃度增加而提高，較合適的抑制濃度為1%～2%。天然產(chǎn)物抑制生物膜形成的機(jī)理目前尚不明確，但生物膜的形成需要菌體分泌大量的多糖和黏性物質(zhì)來維持其三維結(jié)構(gòu)，大蒜提取物等天然產(chǎn)物加入到培養(yǎng)基后，一方面抑制了菌體的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其分泌胞外多糖量下降，空間結(jié)構(gòu)無法維持；另一方面可能影響了菌體的群體效應(yīng)（QS）調(diào)控系統(tǒng)因子的表達(dá)，使得信號(hào)分子無法感應(yīng)細(xì)菌群體的密度，導(dǎo)致生物膜無法形成[22]。

4 結(jié)論

副溶血弧菌一般在培養(yǎng)48～72h時(shí)生物膜達(dá)到成熟階段，之后開始下降。副溶血弧菌形成生物膜的含量與菌株和培養(yǎng)條件相關(guān)，高鹽濃度和高溫有助于其生物膜的形成，副溶血弧菌非致病菌株生物膜的形成量高于致病性菌株。

大蒜提取物和生姜提取物能有效抑制副溶血弧菌生物膜的形成，且抑制作用隨濃度增加而增加，兩者較合適的抑制濃度為1%。茶多酚能有效抑制副溶血弧菌菌體的生長(zhǎng)和生物膜的形成。低濃度的茶多酚（＜0.5%）僅能抑制生物膜的形成；高濃度的茶多酚（＞0.5%）則基本抑制了副溶血弧菌的生長(zhǎng)，從而抑制了生物膜的形成。

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