SDS-AGE在糖尿病腎損傷診斷中的應用

劉彩紅，郭志鵬，閆 峰，艾 清

(吉林大學第一醫(yī)院，長春130031)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴重和最常見的微血管并發(fā)癥之一，是引起終末期腎功能衰竭的主要原因［1，2］。DN早期腎臟的病理改變是可逆的，一旦達到臨床蛋白尿期，患者將出現(xiàn)腎功能不全，病情進展迅速。因此，如能及早診斷并干預治療，可以阻止病情發(fā)展［3］。研究發(fā)現(xiàn)，尿蛋白電泳技術(shù)可對糖尿病患者尿液蛋白成分進行分析，根據(jù)尿蛋白分子大小及組成成分判斷尿蛋白的來源及損傷的部位。十二烷基硫酸鈉—瓊脂糖凝膠電泳(SDS-AGE)較傳統(tǒng)的電泳技術(shù)更為快捷和簡便，更符合目前臨床需求。本實驗通過對糖尿病患者的非濃縮尿進行SDS-AGE分析，并探討此技術(shù)在糖尿病腎損傷診斷中的應用價值。

臨床資料:選擇我院收治的糖尿病患者132例，男78例，女54例;年齡14～77歲;病程1～21 a;均符合1999年WHO糖尿病專家委員會制定的糖尿病診斷標準;排除標準:①近1個月內(nèi)發(fā)生腦卒中、冠心病患者;②合并高血壓患者;③近期使用過腎毒性藥物者;④嚴重的心、肝、血液、結(jié)締組織病者;⑤妊娠及泌尿系統(tǒng)感染者。尿蛋白定性(-)65例，(±)32例，(+)16例，(++)10例，(+++)9例。

SDS-AGE分析方法:所需儀器及試劑為HYDRASYS全自動電泳儀、掃描儀及配套試劑盒(法國Sebia公司)，Siemens BNII全自動蛋白分析儀，尿液干化學分析儀H-500及配套尿液分析試紙條(迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司)，BECKMAN COULTER Allegra X-15R臺式冷凍離心機，生理鹽水(用于尿液的稀釋)。①標本收集與處理:收集患者新鮮非濃縮尿10 mL左右，采用尿液干化學分析儀H-500作尿蛋白定性。定性完成后，將尿液于離心機2 000 r/min離心5 min，取上清于EP管中-80℃冰箱冰凍保存、備用。②操作方法:a.將冰凍保存的尿液室溫放置完全解凍，尿蛋白定性(+++)的用生理鹽水稀釋至(++)或以下，定性(++)或以下的標本可直接使用。b.取20μL SDS溴芬蘭溶液加入一次性試管中，將80μL待測尿液加入其中，充分混勻約5 min。c.接通HYDRASYS儀器的電源，將瓊脂糖凝膠置于電泳板上，?、谥械幕旌弦?μL加入凝膠孔中，裝上緩沖條帶。d.啟動電泳程序，電泳25 min，烘片55 min，染色15 min，脫色55 min，固定10 min。e.掃描并記錄結(jié)果，在570 nm波長下掃描電泳膠片。

結(jié)果:尿蛋白電泳結(jié)果見表1。

表1 尿蛋白電泳結(jié)果(例)

討論:DN是糖尿病患者最嚴重、最常見的微血管并發(fā)癥之一，是引起糖尿病患者死亡的最主要原因之一。近年來，隨著糖尿病患者生存期的延長，DN的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。DN早期腎臟損傷尚處于可逆階段，隨著病情的進展，進入臨床蛋白尿期，腎臟病變將不可逆轉(zhuǎn)，直至發(fā)展為腎功能衰竭，因此DN早期診斷并對其進行干預，對患者來說意義重大。

蛋白尿是腎臟損傷的表現(xiàn)之一，了解蛋白尿的組成可間接判斷腎臟損傷的部位及程度。SDS-AGE利用蛋白質(zhì)與SDS連接，形成SDS-蛋白質(zhì)復合物，SDS-蛋白質(zhì)復合物在具有篩選功能的瓊脂糖凝膠介質(zhì)上電泳，蛋白質(zhì)按照其分子量大小進行分離，通過區(qū)分不同位置的蛋白質(zhì)條帶，判斷蛋白質(zhì)分子的大小，進而可以判斷腎臟損傷部位。正常尿液內(nèi)蛋白含量甚微，多為生理性蛋白尿，含量50～150 mg/d，主要成分為白蛋白(30 mg/d以下)。當腎小球通透性增高或濾膜缺損時，導致正常情況不被腎小球濾膜通過的中、高分子蛋白質(zhì)(超過70 kD)在尿中出現(xiàn)稱腎小球性蛋白尿。腎小管受損時，尿中低分子蛋白(＜70 kD)排泄量增大，稱腎小管性蛋白尿?；旌闲缘鞍啄蚴悄I小管和腎小球同時病變出現(xiàn)高、中、低分子型蛋白區(qū)帶。

報道［4］認為，SDS-AGE非濃縮尿蛋白電泳與腎活檢結(jié)果相符。近年來，腎臟組織活檢一直是診斷腎臟損傷部位及程度的金標準，但腎穿刺屬于創(chuàng)傷性診斷技術(shù)，可能造成出血、感染等并發(fā)癥，且穿刺技術(shù)及取材部位也會影響穿刺的成敗，給患者帶來創(chuàng)傷較大，患者及家屬心存顧慮。而SDS-AGE能在無創(chuàng)傷的情況下對尿蛋白組分進行分析，且患者尿液不需要濃縮可直接檢測，縮短了檢測時間;而且以瓊脂糖為瓊脂的主要成分，受固體支持物影響小，支持體的透明度高，提高了檢測靈敏度和敏感度(敏感度為15 mg/L)［5］，可用于糖尿病早期腎損傷的診斷評價。本研究顯示，本組出現(xiàn)混合性蛋白尿29例，腎小球性蛋白尿18例，腎小管性蛋白尿25例，說明患者腎小球、腎小管或兩者均損傷;出現(xiàn)生理性蛋白尿或蛋白尿陰性60例，說明患者處于正常生理狀態(tài)，腎組織未損傷。上述結(jié)果提示，SDS-AGE可以發(fā)現(xiàn)糖尿病腎損傷，根據(jù)電泳膠片不同區(qū)域出現(xiàn)的蛋白條帶判斷腎臟損傷的部位，根據(jù)蛋白條帶的深淺粗略估計腎臟損傷程度。了解尿液蛋白組分及含量的變化，對腎損傷的診斷、指導治療、判斷預后很重要，SDS-AGE用于糖尿病早期腎損傷的診斷評價是一種有效的方法。

［1］Cooper ME.Is diabetic nephropathy disappearing from clinical practice［J］.Pediatr Diabetes，2006，7(5):237-238.

［2］Jorsal A，Tamow L，Lajer M，et al.The PPAR gamma 2 Pro 12Ala variantpredicts ESRD and mortality in patients with type 1 diabetes and diabeticnephropathy［J］.Mol Genet Metab，2008，94 (3):347-351.

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［5］吳宇芳，關(guān)曉東.腎臟病患者尿蛋白電泳測定及其病理活檢對比分析［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2007，34(4):873-874.