羅曼鶴雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定

李雙星，樸豐源，戚 媛，劉曉輝，李亞晨，劉 爽，李雙月

(1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150001;2大連醫(yī)科大學(xué))

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類來源于中胚層、具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可向骨、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種胚層細(xì)胞分化，已經(jīng)成為組織工程和細(xì)胞移植的重要細(xì)胞來源，在組織功能/結(jié)構(gòu)重建、創(chuàng)傷修復(fù)及人工器官等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［1，2］。有關(guān)BMSCs的研究目前多集中于人、大鼠和小鼠，雞BMSCs相關(guān)的研究報道不多見。雞作為首個進(jìn)行基因組測序的禽類，已揭示了眾多胚胎發(fā)育機(jī)制，動物腫瘤可由病毒引起亦是以雞為模型首次證明，雞是胚胎發(fā)育、腫瘤和免疫系統(tǒng)等研究的重要模型，雞BMSCs已成為相關(guān)研究不可替代的體外模型［3～5］。2009年，Mahesh等首次分離培養(yǎng)出雞BM-SCs，但其采用的密度梯度離心法操作繁瑣，同時亦破壞了BMSCs的生長微環(huán)境，限制了BMSCs的培養(yǎng)和應(yīng)用［6，7］。2012年11月～2013年5月，我們利用全骨髓貼壁法對雞BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定，以期建立一種簡單、高效的雞BMSCs分離、培養(yǎng)體系，為雞BMSCs的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 羅曼鶴雞，1～14天齡，由大連韓偉集團(tuán)提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Hyclone公司)，二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、青霉素、鏈霉素(上海生工生物工程有限公司)，地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、谷氨酰胺、胰島素、異丁基甲基黃嘌呤、吲哚美辛(Sigma公司)，F(xiàn)ITC-CD29抗體、PE-CD34抗體(e-Bioscience公司)。

1.2 雞BMSCs的分離培養(yǎng) 雞脫臼處死，無菌分離完整的股骨及脛骨，清除附著的肌肉組織，暴露骨髓腔并反復(fù)沖洗，尤其是干骺端。將沖出的骨髓細(xì)胞過篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，離心后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸并接種于培養(yǎng)皿，于37℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h后全量換液，以后每3 d換液1次。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，0.25%胰酶消化并按1∶2進(jìn)行傳代，利用差速貼壁特性逐步純化BMSCs。

1.3 雞BMSCs的鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及貼壁狀況，并記錄。

1.3.2 增殖能力檢測 取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs，以4×103/mL接種于96孔板，每組6復(fù)孔，每3 d換液1次，采用MTT法檢測其生長增殖能力。從培養(yǎng)第1天到第7天，每天相應(yīng)復(fù)孔加入20μL MTT(5 g/L)溶液，37℃孵育4 h，小心棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，微量振蕩器震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔光密度值(OD值)，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3.3 表面標(biāo)志物檢測 第3代BMSCs胰蛋白酶室溫消化，離心收集細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液。各樣本分別加入抗CD29和CD34的熒光標(biāo)記抗體，同時設(shè)立同型陰性對照，4℃避光孵育，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.4 雞BMSCs分化能力檢測

1.4.1 雞BMSCs成骨誘導(dǎo)分化 將2×108/L生長狀況良好的第3代BMSCs接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至80%～90%融合時，在各誘導(dǎo)孔加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液含10%胎牛血清、5μg/mL抗壞血酸、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松)，對照孔加入含10%胎牛血清的DMEM常規(guī)完全培養(yǎng)液，每3天換液1次。誘導(dǎo)分化第21天進(jìn)行茜素紅染色。

1.4.2 雞BMSCs成脂誘導(dǎo)分化 選用第3代生長狀態(tài)良好的 BMSCs，2×108/L接種，待細(xì)胞長至80%～90%融合時，在各誘導(dǎo)孔加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)液含10%胎牛血清、5μg/mL胰島素、1μmol/L地塞米松、10 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、600 nmol/L吲哚美辛)，對照孔加入DMEM常規(guī)完全培養(yǎng)液，每3天換液1次。誘導(dǎo)分化第14天進(jìn)行油紅O染色。

2 結(jié)果

2.1 雞BMSCs形態(tài)學(xué)變化 雞骨髓細(xì)胞初始接種時懸浮于培養(yǎng)液中，24 h后部分細(xì)胞貼壁，呈短梭形、多角形等形態(tài);6 d后部分細(xì)胞形成散在集落，細(xì)胞突起變長、變大，并且長短不一、粗細(xì)不均(圖1A);14 d左右細(xì)胞集落相互靠近并融合成片(圖1B)。傳代后細(xì)胞生長速度明顯變快，細(xì)胞形態(tài)趨向均一，長梭形、束狀或漩渦狀排列(圖1C)。

圖1 雞BMSCs的形態(tài)學(xué)變化

2.2 雞BMSCs生長曲線 見圖2。由圖2可見，雞BMSCs的生長潛伏期為1～3 d，之后進(jìn)入對數(shù)生長期，第6天以后開始進(jìn)入平臺期。

圖2 第3代雞BMSCs生長曲線

2.3 雞BMSCs表面標(biāo)志物 流式檢測結(jié)果顯示，BMSCs的表面標(biāo)志物 CD29的陽性表達(dá)率為92.10%，造血系細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34表達(dá)率僅為0.80%(圖3)，提示第3代貼壁細(xì)胞主要是BMSCs。

2.4 雞BMSCs成骨誘導(dǎo)分化情況 成骨誘導(dǎo)第7天可見部分細(xì)胞聚集成團(tuán)、呈放射狀排列，10 d左右出現(xiàn)細(xì)胞聚集形成的結(jié)節(jié)，之后結(jié)節(jié)逐漸增多，部分細(xì)胞輪廓不清、透光性差。雞BMSCs誘導(dǎo)分化進(jìn)行第21天茜素紅染色，陽性區(qū)域呈現(xiàn)鮮紅色，有明顯的礦化結(jié)節(jié)形成，見圖4。對照孔內(nèi)未見著色區(qū)域。

圖3 雞BMSCs表面標(biāo)志物表達(dá)情況

圖4 雞BMSCs來源的成骨細(xì)胞茜素紅染色(×200)

2.5 雞BMSCs成脂誘導(dǎo)分化情況 BMSCs成脂誘導(dǎo)14 d后，細(xì)胞密度減低，細(xì)胞間空隙增大，可見圓形高亮細(xì)胞，有些橢圓形細(xì)胞內(nèi)可見呈串珠樣排列分布的脂樣小滴，脂滴變大并合并呈串珠狀。油紅O染色顯示胞質(zhì)內(nèi)有大量鮮紅色串珠樣或大的融合脂滴，細(xì)胞體積較大呈圓形(圖5)。對照細(xì)胞染色無脂質(zhì)沉積。

圖5 雞BMSCs來源的成脂細(xì)胞油紅O染色(×100)

3 討論

雞胚是發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血管藥理學(xué)等研究的理想模型，成年雞更是遲發(fā)性神經(jīng)毒性等研究不可替代的動物模型。而有關(guān)BMSCs的研究目前多集中于人和嚙齒類動物，家禽中多集中于豬，雞BMSCs的相關(guān)報道較少。本研究利用差速貼壁法，從羅曼鶴雞的骨髓中分離培養(yǎng)出高純度、高分化潛能的BMSCs。

目前，BMSCs體外分離培養(yǎng)體系主要包括密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠法、全骨髓貼壁法。密度梯度離心法可根據(jù)細(xì)胞密度的不同提取出單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，但操作較繁瑣、細(xì)胞獲得量較低。流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠法雖可獲得純度較高的BMSCs，但對細(xì)胞活性有較大損傷，且價格昂貴，難以普及［8］。差速貼壁培養(yǎng)法是根據(jù)BMSCs的貼壁特性，通過定期換液去除骨髓中的不貼壁細(xì)胞的分離方法。此種方法篩選出的BMSCs活性高，損傷小，而且骨髓中的其他干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞能分泌生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)，模擬體內(nèi)微環(huán)境，促進(jìn)BMSCs貼壁生長，BMSCs能較快適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞增殖迅速［9］。要獲得較大數(shù)量、活性較高的BMSCs，全骨髓貼壁法更為可取。

各種屬來源的BMSCs目前均缺乏特異性的檢測指標(biāo)，通常根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖特點、相對特異的表面標(biāo)記和多向分化潛能等方面相結(jié)合來對其進(jìn)行鑒定，雞BMSCs亦是如此。本實驗羅曼鶴雞骨髓中分離的單個核細(xì)胞，通過差速貼壁篩選能夠生長形成長梭形或成纖維細(xì)胞樣、呈束裝或旋渦狀排列的細(xì)胞克隆，與間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征一致［10］。細(xì)胞生長曲線是判斷細(xì)胞活性的重要指標(biāo)。細(xì)胞傳代后，一般先是短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的對數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。本研究用MTT法檢測并繪制了第3代雞BMSCs的生長曲線，經(jīng)過3～6 d的對數(shù)生長期后進(jìn)入平臺期。田少囡等［11］報道，北京油雞肺間充質(zhì)干細(xì)胞在最佳培養(yǎng)體系內(nèi)對數(shù)生長期可持續(xù)約4 d，品系及組織來源可能會影響間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性。高健等［12］報道，家禽中豬BMSCs的細(xì)胞活性也受品系影響，進(jìn)一步證實了本實驗結(jié)果。

BMSCs目前缺乏特異性的表面標(biāo)記物，一般認(rèn)為CD29、CD90、CD105等都可作為BMSCs的重要標(biāo)記物，而CD34、CD45等為造血系細(xì)胞的表面標(biāo)志物，在BMSCs上不表達(dá)［13～16］。本實驗參考相關(guān)文獻(xiàn)報道，選擇CD29和CD34作為甄別BMSCs的標(biāo)記物。結(jié)果證明，本研究得到了純度較高的BMSCs。

判定BMSCs的另一個重要指標(biāo)是看其是否具有多向分化能力。分離的雞BMSCs向成骨細(xì)胞分化21 d后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性，顯示細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞并有分泌鈣質(zhì)的功能。雞BMSCs向脂肪細(xì)胞分化14 d后，細(xì)胞油紅O染色陽性，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)小滴，證明細(xì)胞已向成脂細(xì)胞分化。

總之，本實驗成功分離培養(yǎng)出羅曼鶴雞BMSCs并進(jìn)行了相關(guān)鑒定，建立了適合雞BMSCs的體外培養(yǎng)和鑒定體系，為進(jìn)一步深入研究提供了實驗基礎(chǔ)。

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