HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定金銀花中7種多酚類物質(zhì)

游玉明，陳澤雄，張美霞，冉 烈

（重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶402160）

金銀花（Lonicera japonica）又名忍冬花、銀花、雙花等，為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的花蕾，主要分布于我國(guó)山東、河南、陜西等省[1]。金銀花中含有多酚類、皂苷、揮發(fā)油和環(huán)烯醚萜類等多種生物活性成分[2-3]，因而具有廣譜抑菌、抗病毒、消炎、保肝利膽及增強(qiáng)免疫等功效[4-7]，是我國(guó)衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物材料之一，具有較高的食用及藥用價(jià)值[8]。多酚類化合物是高等植物中普遍存在的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性，是金銀花的主要有效成分[9-11]。目前，分析金銀花多酚類化合物的方法主要有分光光度法[12]、高效液相色譜法[13-14]、毛細(xì)管電泳法[15-16]及高效液相色譜-質(zhì)譜法[17-18]等。分光光度法只能測(cè)定總酚含量，不能測(cè)定單體酚類物質(zhì)的含量。高效液相色譜-質(zhì)譜法多為定性篩查，且方法使用的儀器設(shè)備成本高，不易普及。高效液相色譜法具有高效、靈敏度和檢出率高、且易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，是目前使用最廣泛的方法，但近年來所報(bào)道的文獻(xiàn)中均只檢測(cè)了金銀花中綠原酸和木犀草苷等藥典中規(guī)定的指標(biāo)性成分或者少數(shù)幾種黃酮類化合物[19-21]，而對(duì)于金銀花中綠原酸、木犀草苷、蘆丁、咖啡酸等7種多酚類化合物的同時(shí)分離測(cè)定，還未見報(bào)道。因此，本研究采用HPLC-DAD法建立了一種可同時(shí)測(cè)定金銀花中7種多酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上，選擇幼蕾、三青、二白等金銀花7個(gè)典型性花期，研究不同花期對(duì)金銀花中多酚含量的影響，以期為金銀花的品質(zhì)控制、藥理作用機(jī)理及其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 選自重慶市秀山縣金銀花主栽品種“渝蕾一號(hào)”，根據(jù)花期共采集幼蕾、三青、二白、大白、銀花、金花、凋花共7個(gè)花期的樣品。采摘后立即采用真空冷凍干燥機(jī)干燥后保存于陰涼干燥處；綠原酸（Chlorogenic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、香豆酸（p-Coumalic acid）、肉桂酸（trans-Cinnam ic acid）、木犀草苷（Luteolin-7-O-glucoside）、蘆?。≧utin），純度95%以上 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純 成都市科龍化工試劑廠；乙醇、甲酸為分析純 重慶川東化工有限公司。

LC-20A型高效液相色譜儀（配有LC-20AT泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、SPDM 20A型二級(jí)管陣列檢測(cè)器、CTO-20A型柱溫箱）日本島津公司；ALPHA 1-4型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；3-18K型離心機(jī) 德國(guó)SIGMA公司；SB-5200D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW 100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取綠原酸、阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50～65mg，木犀草苷5.8mg，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇定容至10m L，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于-20℃冰箱中保存。待用時(shí)分別準(zhǔn)確吸取不同體積綠原酸、阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸、蘆丁及木犀草苷的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，將其中除木犀草苷外的6種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用70%甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.5～500mg/L，木犀草苷的質(zhì)量濃度為0.5～50mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：島津Shim-packVP-ODS C18柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：A相為2%甲酸，B相為2%甲酸甲醇；梯度洗脫程序?yàn)椋?.01～8.00m in維持15%B，8.01～25.00m in 15%～50%B，25.01～40.00維持50%B，40.01～45.00min 50%～90%B，45.01～50.00min 90%～15%B，50.01～60.00m in 15%B；流速：0.7m L/m in；柱溫35℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：280、320、360nm。

1.2.3 樣品的制備 準(zhǔn)確稱取過40目篩的金銀花粉末0.25g，加入20m L體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，稱定質(zhì)量，于室溫下超聲提取30m in，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液補(bǔ)足減輕的重量，搖勻，過濾，取濾液置離心機(jī)中4000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，上機(jī)測(cè)定[22-23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 將7種多酚類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制成50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)掃描圖譜見圖1。結(jié)果顯示，肉桂酸在280nm附近處有最大吸收峰，4種肉桂酸的衍生物：香豆酸、綠原酸、咖啡酸及阿魏酸均在320nm附近有最大吸收峰，而屬黃酮類物質(zhì)的蘆丁和木犀草苷在360nm附近處有最大吸收峰。因此，選擇280nm作為肉桂酸的檢測(cè)波長(zhǎng)，320nm作為4種肉桂酸衍生物的檢測(cè)波長(zhǎng)，360nm作為2種黃酮類物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 7種多酚類化合物紫外吸收光譜圖Fig.1 UV-spectrum of seven phenolic compounds

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 利用高效液相色譜法測(cè)定多酚類化合物的流動(dòng)相通常由甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑和甲酸、乙酸、三氟乙酸等少量酸性調(diào)節(jié)劑組成[24-25]。分別考察了甲醇-2%甲酸、2%甲酸甲醇-2%甲酸、乙腈-2%甲酸、2%甲酸乙腈-2%甲酸對(duì)7種多酚類化合物的分離情況。在所設(shè)定的條件下，發(fā)現(xiàn)甲醇-2%甲酸會(huì)導(dǎo)致綠原酸等酚酸類物質(zhì)出現(xiàn)拖尾峰，且木犀草苷和蘆丁不能實(shí)現(xiàn)有效分離，而2%甲酸甲醇-2%甲酸和2%甲酸乙腈-2%的甲酸溶液作為流動(dòng)相均可獲得較好的分離效果，但乙腈毒性較大，故選擇2%甲酸甲醇-2%甲酸溶液作為流動(dòng)相。在該條件下，7種多酚類化合物標(biāo)樣和金銀花樣品色譜圖見圖2。

圖2 7種多酚類化合物混合標(biāo)樣（A）和金銀花樣品（B）在280nm處的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sevenmixed phenolic compounds standards（A）and Lonicera japonica（B）at 280nm

表1 不同提取次數(shù)對(duì)7種多酚類化合物回收率的影響（%）Table1 Effectof differentextract times on the recoveries of seven phenolic compounds（%）

表2 7種多酚類化合物的保留時(shí)間、回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢測(cè)限Table2 Retention times，linear equations，correlation coefficients and LOD of seven phenolic compounds

2.2 前處理方法的確立

一般金銀花多酚類化合物的提取采用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液[11，22-23]。本實(shí)驗(yàn)用70%的乙醇溶液按照1.2.3的方法采用超聲對(duì)加標(biāo)樣品分別進(jìn)行處理1、2、3次，測(cè)定其回收率。由表1可知，超聲處理次數(shù)的改變，對(duì)7種多酚類化合物回收率的影響不同，其中木犀草甘、蘆丁隨提取次數(shù)的增加，其回收率有所增加，而綠原酸、咖啡酸和香豆酸隨提取次數(shù)的增加，其回收率反而降低。這可能是各多酚類化合物對(duì)超聲穩(wěn)定性不同所致[26]。故采用70%乙醇溶液超聲提取1次，各組分提取良好，能滿足提取要求。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系及檢出限 將不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按1.2.2節(jié)的色譜條件進(jìn)行分析，以測(cè)得的各個(gè)多酚類化合物積分峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各多酚類化合物的保留時(shí)間、線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限如表2所示。7種多酚類化合物的檢出限（RSN=3）為0.001～0.078mg/L，在各多酚類化合物相應(yīng)的線性范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與積分峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9964以上。

2.3.2 精密度及穩(wěn)定性 將同一質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行5次日內(nèi)和3次日間測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得各化合物的日內(nèi)精密度和日間精密度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。方法的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.33%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.27%，表明分析方法重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。

2.3.3 回收率 本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行方法準(zhǔn)確度測(cè)定。取已知含量的樣品3份，分別加入一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.3節(jié)方法處理樣品，在1.2.2節(jié)所述條件下進(jìn)行測(cè)定，以3次進(jìn)樣測(cè)定計(jì)算平均值。測(cè)定結(jié)果如表4所示，各組分的回收率在93.42%～102.53%之間。說明方法加標(biāo)回收效果較好，可用于金銀花中綠原酸、木犀草苷及咖啡酸等7種多酚類化合物的含量測(cè)定。

表3 7種多酚類化合物的精密度（n=5）Table3 Precision of seven phenolic compounds（n=5）

表4 7種多酚類化合物的回收率（n=3）Table4 Recovery rates of seven phenolic compounds（n=3）

2.4 實(shí)際樣品分析

對(duì)不同花期的金銀花樣品按1.2.3節(jié)方法處理，并在1.2.2節(jié)所述條件下進(jìn)行測(cè)定，各花期金銀花樣品中7種多酚類化合物的含量，如表5所示。由表5可知，金銀花在幼蕾期和三青期中7種多酚類化合物均被檢出，而后香豆酸未被檢出，7種多酚類化合物中含量最高的是綠原酸，其次是蘆丁和木犀草苷。其中綠原酸在各花期中的含量表現(xiàn)為先上升后降低，在二白期含量達(dá)到最高，幼蕾期最低，這與劉偉等的研究結(jié)果一致[27]，而木犀草苷含量在銀花期達(dá)到最高，但總體而言，7種多酚類化合物的總量在二白期最高，達(dá)到44.554mg/g，而在幼蕾期最低，為16.988mg/g。

表5 金銀花中7中多酚類化合物的含量（mg/g）Table5 Contents of seven phenolic compounds in Lonicera japonica（mg/g）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定金銀花中7種多酚類化合物的方法，采用2%甲酸甲醇-2%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，能將7種多酚類化合物有效分離，在此條件下，測(cè)定不同花期金銀花中7種多酚類化合物，其含量存在較大差異，二白期含量最高，為44.554mg/g。該方法前處理簡(jiǎn)便，靈敏度高、可靠、重現(xiàn)性好，可用于金銀花中7種多酚類化合物含量的檢測(cè)，具有實(shí)用價(jià)值。

[1]關(guān)炳峰，譚軍，周志娣.金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關(guān)性研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（10）：127-129.

[2]ChoiCW，Jung H A，Kang SS，etal.Antioxidant Constituents and a New Triterpenoid Glycoside from Flos Lonicera[J].Arch Pharmacal Res，2007，30（1）：1-7.

[3]王芳，蔣躍平，王曉良，等.金銀花的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（9）：1378-1385.

[4]Liao Yanyan，Dong Sijun，Kilama R，et al.Flos Lonicerae Extracts and Chlorogenic Acid Protect Human Umbilical Vein Endothelial Cells from the Toxic Damage of Perfluorooctane Sulphonate[J].JInflammation，2013，36（3）：767-779.

[5]Chen Weicheng，Liou SS，Tzeng T F，et al.Wound Repair and Anti-inflammatory Potential of Lonicera japonica in Excision Wound-induced Rats[J].Complementary&Alternative Medicine，2012，12：226-234.

[6]Lee H，Lee G，Yoon M S，et al.Effect of Fermented Lonicera japonica on LPS-induced Acute Lung Inflammation[J].Orient Pharm Exp Med，2011，11（4）：287-292.

[7]Teng Yang，Sun Changhai，Li Guangzhi，et al.Protective Effects of Flos lonicera Extract on Acute Liver Injury by Dimethylnitrosamine-induced in Rats[J].J Nat Med，2010，64（3）：288-294.

[8]陳雅文.淺談金銀花的化學(xué)成分、藥理作用和實(shí)用價(jià)值[J].中國(guó)民間療法，2013，21（5）：70-71.

[9]Narang J，Chawla S，Chuauhan N，et al.Construction of an amperometric polyphenol biosensor based on PVA membrane[J].Food Measure，2013，7（1）：22-28.

[10]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：205-206.

[11]陳奇，鄧雁如，夏娜.金銀花多酚類物質(zhì)的純化研究[J].藥物評(píng)價(jià)，2012，35（3）：185-189.

[12]肖卓炳，郭瑞軻，郭滿滿，等.金銀花中綠原酸超聲微波雙輔助提取工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2012，33（22）：111-114.

[13]Zhou Yuanzhen，Liu Xiaoxing，Zheng Xiaohui，et al.Simultaneous Determination of Quercetin and Luteolin in Dried Flowers by Multivariate HPLC-ECD Calibration[J].Chromatographia，2007，66（7/8）：635-637.

[14]Ren Jing，Jiang Xuehua，Li Chenrui，et al.Investigation on the Absorption Kinetics of Chlorogenic Acid in Rats by HPLC[J].Archives of Pharmacal Research，2007，30（7）：911-916.

[15]Zhao Y K，Cao QE，Liu H T，etal.Determination of Baicalin，Chlorogenic Acid and Caffeic Acid in Traditional Chinese Medicinal Preparations by Capillary Zone Electrophoresis[J].Chromatographia，2000，51（7/8）：483-486.

[16]顏流水，溫振東，黃智敏，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定金銀花中綠原酸、蘆丁和槲皮素[J].藥物分析雜志，2007，27（3）：367-370.

[17]Qi Lianwen， Chen Chunyun， Li Ping.Structural Characterization and Identification of Iridoid Glycosides，Saponins，Phenolic Acids and Flavonoids in Flos Lonicerae Japonicae by a Fast Liquid Chromatography Method with Diodearray Detection and Time-of-flight Mass Spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23（19）：3227-3242.

[18]Luo Yongdong，Wu Shuisheng，Li Xiaoyan，et al.LC-ESIMS-MS Determination of Rat Plasma Protein Binding of Major Flavonoids of Flos Lonicerae Japonicae by Centrifugal Ultrafiltration[J].Chromatographia，2012，72（1）：71-77.

[19]胥秀英，鄭一敏，傅善權(quán)，等.高效液相色譜法測(cè)定金銀花中木犀草素的含量[J].食品科學(xué)，2006，27（5）：221-222.

[20]王艷艷，徐曉玉，鄧君，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定灰氈毛忍冬中綠原酸與木犀草苷的含量[J].中藥材，2009，32（11）：1705-1707.

[21]王麗婷，楊敏麗.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花及葉中的黃酮類物質(zhì)[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（8）：1850-1851.

[22]辛華，豐杰，程若敏，等.HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地金銀花中綠原酸和木犀草苷[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（2）：60-63.

[23]Yuan Yan，Song Lipu，Li Guiming，et al.Genetic Variation and Metabolic Pathway Intricacy Govern the Active Compound Content and Quality of the Chinese Medicinal Plant Lonicera Japonica Thunb[J].Genomics，2012，13：195-211.

[24]Tarola A M，Velde F V，Salvagni L，et al.Determination of Phenolic Compounds in Stawberries（Fragaria ananassa Duch）byHigh Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection[J].Food AnalMethods，2013，6（1）：227-237.

[25]Tian Su，Nakamura K，Cut Tong，et al.High-performance Liquid Chromatography Determination of Phenolic Compounds in rice[J].JChromatography A，2005，1063（1/2）：121-128.

[26]馬亞琴，葉興乾，吳厚玖，等.超聲處理對(duì)琯溪蜜柚皮中多組分酚酸穩(wěn)定性的影響[J].食品科學(xué)，2013，34（19）：27-31.

[27]劉偉，鄭振佳，周潔，等.良種金銀花不同采收期發(fā)育程度與品質(zhì)比較研究[J].山東科學(xué)，2012，25（2）：35-38.