患病牦牛源大腸桿菌對10種不同抗菌藥物敏感性試驗

陳朝喜, 張郁, 西格基

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2.黑水縣畜牧獸醫(yī)局, 四川 阿壩 623500)

患病牦牛源大腸桿菌對10種不同抗菌藥物敏感性試驗

陳朝喜1#, 張郁1#, 西格基2

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2.黑水縣畜牧獸醫(yī)局, 四川 阿壩 623500)

采用K-B紙片擴散法對67株患病牦牛源大腸桿菌進行粘桿菌素、多西環(huán)素、利福平等10種不同抗菌藥物敏感性試驗, 試驗數(shù)據(jù)采用Whonet5.4軟件統(tǒng)計以分析牦牛源大腸桿菌的耐藥率和耐藥譜型. 結(jié)果表明, 牦牛源大腸桿菌對乙酰甲喹的耐藥率為41.79%, 其余9個藥的耐藥率均在80%以上, 其中利福平、土霉素的耐藥率為100%. 耐藥譜型以粘桿菌素/多西環(huán)素/利福平/磺胺嘧啶/替米考星/土霉素/萘啶酸/磺胺間甲嘧啶/磺胺二甲嘧啶為優(yōu)勢耐藥譜型.

牦牛; 大腸桿菌; 耐藥率; 耐藥譜型

牦牛大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌(埃希氏大腸桿菌)引起的一種急性傳染病, 是目前危害牦牛生產(chǎn)的主要疾病之一[1]. 該病既是原發(fā)性疾病又可繼發(fā)多種疾病, 具有較高的發(fā)病率和死亡率[2]. 該病在牧區(qū)普遍存在,給牦牛業(yè)帶來了不容忽視的經(jīng)濟損失. 抗菌藥物的應(yīng)用為動物生產(chǎn)和疾病的防治提供了極大的便利, 因此在畜牧業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用, 為我國畜牧業(yè)發(fā)展做出了很大的貢獻. 但是隨著抗菌藥物的大量使用和不合理應(yīng)用,細菌耐藥性問題也越來越嚴重. 為調(diào)查大腸桿菌耐藥性流行和發(fā)展現(xiàn)狀, 本研究于2012年11月在成都市青白江區(qū)某牦牛屠宰場和阿壩州紅原縣、松潘縣和茂縣等采集的患病牦牛病料,分離得到67株大腸桿菌, 對其進行了常規(guī)的大腸桿菌的分離鑒定并運用K-B紙片擴散法, 檢測了分離的大腸桿菌對10種不同抗菌藥物的耐藥情況, 確定其對抗菌藥物的敏感性, 找到牦牛源大腸桿菌的優(yōu)勢耐藥譜型. 為指導(dǎo)獸醫(yī)臨床合理用藥、科學(xué)選擇藥物, 還可以為耐藥性相關(guān)研究提供材料和依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

137個樣本于2012年11月在成都市青白江區(qū)某牦牛屠宰場和阿壩州紅原縣、松潘縣和茂縣采集, 其中包括牦牛糞便、尿液及土壤樣本. 用棉拭子蘸取牦牛剛排出的糞便、尿液, 將蘸有糞便的棉拭子迅速放入提前配臵好裝有LB肉湯的滅菌塑料管內(nèi), 蓋上塞子. 土壤樣本直接從屠宰場周圍采集.

1.1.2 藥物

粘桿菌素(Pmb), 多西環(huán)素(Dox), 利福平(Rif), 磺胺嘧啶(SD-Na), 替米考星(Til), 乙酰甲喹(Meq), 土霉素(Otc), 萘啶酸(Nac), 磺胺間甲嘧啶(SMM), 磺胺二甲嘧啶(SM2)共10種抗菌藥物原料藥粉均由成都中牧藥業(yè)股份有限責任公司提供, 所有藥物臨用前均配成5120μg/mL的母液備用.

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌的分離和鑒定

方法[3]對采集樣本進行增菌培養(yǎng). 選取玫瑰紅色、濕潤、邊緣整齊、大小適中的單個菌落進行革蘭氏染色鑒定, 光學(xué)顯微鏡下觀察大腸桿菌為紅色、中等大小、兩端鈍圓的短桿狀菌體.

1.2.2 藥敏片的制作

取質(zhì)量較好的定量濾紙, 用普通打孔器打成直徑6mm的圓形小紙片, 取一定數(shù)量紙片放入配好的藥液中,同時記錄藥物名稱, 臵于37℃培養(yǎng)箱中過夜; 24h后觀察小瓶中的液體是否渾濁, 若渾濁說明藥液被污染, 則棄去不用; 若不渾濁則用注射器吸干藥液. 臵于37℃培養(yǎng)箱中使其完全干燥. 干燥后取出放入4℃的冰箱中保存[4].

1.2.3 藥敏試驗及結(jié)果處理

采用K-B紙片擴散法進行藥物敏感性試驗, 測量抑菌圈(直徑)的大小, 按照美國實驗室標準委員會(NCCLS)藥敏試驗紙片擴散法標準進行判定, 試驗數(shù)據(jù)采用Whonet5.4軟件進行統(tǒng)計分析.

2 結(jié)果分析

2.1 大腸桿菌的分離和鑒定

從97份病料中共分離純化得到67株可疑大腸桿菌, 經(jīng)革蘭氏染色和生化鑒定確定為大腸桿菌, 確定其分離率為69.07%.

2.2 藥敏試驗結(jié)果及耐藥性結(jié)果

利用Whonet5.4軟件對10種藥物的藥敏試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理, 67株大腸桿菌對10種抗菌藥物的抑菌圈大小情況和耐藥性分析結(jié)果分別見表1和見圖1. 從中可以看出: 分離的患病牦牛源大腸桿菌對受試藥物的耐藥率較高, 除了乙酰甲喹的耐藥率為41.79 %, 其他藥物的耐藥率均達到80%以上, 而利福平、土霉素的耐藥率達到100%.

表1 患病牦牛源大腸桿菌對10種抗菌藥物的耐藥率匯總

2.3 大腸桿菌耐藥譜型分析

利用Whonet5.4軟件分析67株大腸桿菌對10種藥物存在19種不同耐藥譜型, 其中以粘桿菌素/多西環(huán)素/利福平/磺胺嘧啶/替米考星/土霉素/萘啶酸/磺胺間甲嘧啶/磺胺二甲嘧啶為優(yōu)勢耐藥譜型, 耐藥譜型分析見表2.

3 分析與討論

3.1 患病牦牛源大腸桿菌的耐藥性

抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中進行預(yù)防性用藥可對疾病的預(yù)防和控制產(chǎn)生一定的效果, 同時也導(dǎo)致了濫用藥物而帶來的細菌耐藥性問題. 本試驗67株大腸桿菌中, 牦牛源大腸桿菌除對乙酰甲喹的耐藥率較低外, 對其它藥物的耐藥率均較高, 利福平、土霉素甚至達到完全耐藥. 通過耐藥譜型的分析發(fā)現(xiàn), 牦牛源大腸桿菌的耐藥譜型均超過5種藥物, 出現(xiàn)了多重耐藥的現(xiàn)象. 相關(guān)研究表明有病亂投藥是大腸桿菌容易產(chǎn)生耐藥性的自身原因[5].

圖1 患病牦牛源大腸桿菌對10種抗菌藥物的耐藥性分析

表2 67株患病牦牛源大腸桿菌對10種抗菌藥物的耐藥譜型

3.2 患病牦牛大腸桿菌耐藥原因分析及對策

本研究結(jié)果顯示, 分離菌株表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象, 可能與臨床的不合理用藥和長期用藥有關(guān). 與我們前期的試驗結(jié)果相比, 本年度分離的大腸桿菌和沙門氏菌的耐藥率均比前期較高[6-7]. 同時, 因為本研究分離菌株的目的為后續(xù)探討耐藥基因和毒力因子相關(guān)性提供材料, 因此在采樣過程中我們主要針對患病牦牛及其生活環(huán)境,這也可能是試驗結(jié)果耐藥率偏高的一個原因. 但通過本實驗可以為臨床患病牦牛的防治和抗菌藥物的合理使用提供一定的指導(dǎo), 避免盲目選用藥物造成耐藥性的蔓延和疾病的遷延不愈, 間接增加養(yǎng)殖成本.

參考文獻:

[1] 汪洋, 易力, 王紅寧, 等. 川西北牦牛致病性大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2008, 44(5): 36-37.

[2] 陳明勇, 張冰, 陳德威, 等. 西藏地區(qū)牦牛致病性大腸桿菌的分離鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2001, 23(5): 389-390.

[3] 陳朝喜, 朱恒乾, 廖曉萍, 等. 大腸埃希菌耐藥譜型、基因型和生物膜表型關(guān)系研究[J]. 動物醫(yī)學(xué)展, 2011, 32(4): 59-62.

[4] 譚瑤, 趙清, 舒為群, 等. K-B紙片擴散法藥敏試驗[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)與臨床, 2010, 7(20): 2290-2291.

[5] 張秀英, 盧秀梅. 大腸桿菌對獸醫(yī)臨床抗菌藥物耐藥情況分析[J]. 河北畜牧獸醫(yī), 2003, 19(5): 15-19.

[6] 陳朝喜, 杜雄偉, 師志海. 不同來源沙門氏菌的分離鑒定及其耐藥譜型比較[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 51(21): 4834-4836.

[7] 師志海, 王文佳, 蘭亞莉, 等. 寵物源性大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39(7): 223-224.

Drug sensitivity tests of Escherichia coli isolated from sick yak to ten different antibacterial drugs

CHEN Chao-xi1, ZHANG Yu1, XI Ge-ji2
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Heishui County, Aba 623500, P.R.C.)

K-B disc diffusion test method and Whonet5.4 software are used for antimicrobial susceptibility testing of 67 strainsEscherichia colito 10 different antibacterial agents such as Colistin, Doxycycline and Rifampicin, and drug resistance rate and drug resistance spectrum analysis are conducted. The results show that drug resistant rate for Mequindox is 41.79%, and resistant rates of the other nine drugs are more than 80%, for Rifampicin and Oxytetracycline the drug resistance rates are 100%. The predominant drug resistance spectrum is Pmb/Dox/Rif/SD-Na/Til/Otc/Nac/SMM/SM2.

yak;Escherichia coli; drug resistant rate; drug resistance spectrum

S859

A

1003-4271(2014)01-0020-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.04

2013-12-06

陳朝喜(1980-), 男, 博士, 副教授, 主要從事獸藥殘留及細菌耐藥機制研究. #為同等貢獻作者.

西格基(1971-), 男, 藏族, 獸醫(yī)師.