藏雞FSHβ、POU1F1和FSHR的基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系

楊孔， 楊艾琳, 吳夢(mèng)玲

(1. 西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041; 2. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院, 四川 成都 610041)

【特約專(zhuān)稿】

藏雞FSHβ、POU1F1和FSHR的基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系

楊孔1,2#， 楊艾琳1,2#, 吳夢(mèng)玲1,2

(1. 西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川 成都 610041; 2. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院, 四川 成都 610041)

目的：通過(guò)研究藏雞FSHβ、POU1F1和FSHR的基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系, 在分子水平上分析其產(chǎn)蛋性能低下的原因, 目的是篩選出高產(chǎn)基因型以幫助選育高產(chǎn)藏雞, 為保護(hù)純種藏雞、促進(jìn)規(guī)?；B(yǎng)殖提供理論依據(jù)和指導(dǎo). 方法: 以高產(chǎn)蛋量雞品種羅曼雞為對(duì)照, 選擇禽類(lèi)繁殖調(diào)控軸上的促卵泡激素β亞基(FSHβ)、垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1(POU1F1)和促卵泡激素受體(FSHR)三個(gè)基因, 克隆、分析這三個(gè)基因部分編碼區(qū)(CDS區(qū))單核苷酸序列多態(tài)性(SNP)及其與藏雞產(chǎn)蛋量的相關(guān)性.結(jié)果:1.藏雞與羅曼雞FSHβ基因第2外顯子和第3外顯子種內(nèi)、種間均不具有多態(tài)性, 表現(xiàn)為單一基因型. 2.POU1F1基因exon3, exon4和exon6在藏雞和羅曼雞種間存在SNP位點(diǎn), 具有各自獨(dú)特的基因型. exon3上藏雞為AA基因型, 羅曼雞為AB基因型; exon4上藏雞為CC基因型, 羅曼雞為CD基因型; exon6上藏雞為T(mén)T基因型, 羅曼雞為T(mén)W基因型. 而該基因第5外顯子序列在兩物種的種內(nèi)和種間均未表現(xiàn)出多態(tài)性. 3. FSHR基因exon1和 exon4在藏雞和羅曼雞種間存在SNP位點(diǎn). exon1上藏雞為EE基因型, 羅曼雞為EF基因型; exon4上藏雞表現(xiàn)為3種基因型(GH, GI, HI), 而在羅曼雞上僅具有一種基因型(GH), 且羅曼雞的基因型與藏雞種群內(nèi)的一種相同.結(jié)論: 1.FSHβ基因不具有多態(tài)性, 與產(chǎn)蛋量間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究. 2. POU1F1基因exon3, exon4和exon6具有多態(tài)性. 此3個(gè)片段的核苷酸突變位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在兩個(gè)種群間呈極顯著性差異(P<0.01), 這6個(gè)SNP與藏雞產(chǎn)蛋量具有顯著相關(guān)性. 3. FSHR基因的exon1和exon4具有多態(tài)性. 此2個(gè)片段的核苷酸突變位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在兩個(gè)種群間呈極顯著性差異(P<0.01), 該基因的SNP與產(chǎn)蛋量具有顯著相關(guān)性.

藏雞; FSHβ; POU1F1; FSHR; 多態(tài)性; 產(chǎn)蛋性能

藏雞是藏區(qū)人民采用粗放模式飼養(yǎng)的地方原始小型品種[1], 藏雞表現(xiàn)出優(yōu)秀的耐高原能力、耐粗飼料等特性,它在2006年被列為國(guó)家級(jí)畜禽保護(hù)品種[2-4]. 藏雞產(chǎn)品的食用性能優(yōu)秀, 具有極大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值. 首先, 藏雞蛋中的鐵、鋅和鈣元素含量比普通雞蛋中的高, 分別為11.10mg／kg、12.41mg／kg和393.67mg／kg. 第二, 藏雞蛋的粗蛋白含量和粗脂肪含量分別為12.83%和8.91%, 均比普通雞蛋高. 第三, 因?yàn)椴仉u生活在青藏高原無(wú)污染的環(huán)境里, 藏雞蛋和藏雞肉是天然綠色的保健食品[5]. 但是, 近年來(lái)由于其繁殖力弱, 產(chǎn)蛋量低, 當(dāng)?shù)鼐用褚N具有高產(chǎn)性能的外來(lái)雞種, 一方面導(dǎo)致純種藏雞分布范圍縮小, 數(shù)量銳減; 另一方面外來(lái)雞種和藏雞雜交, 導(dǎo)致藏雞種質(zhì)資源異化, 或者純種藏雞近親繁殖導(dǎo)致遺傳多樣性丟失, 其生理性能和繁殖性能等方面出現(xiàn)不同程度的減退[6]. 因此, 研究藏雞繁殖性能, 篩選高生產(chǎn)性能的藏雞, 對(duì)保護(hù)藏雞遺傳多樣性、促進(jìn)藏雞規(guī)?；B(yǎng)殖具有重要意義.

在繁殖調(diào)控軸上, 促卵泡激素是影響雌性動(dòng)物的重要激素, 它直接影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和卵泡顆粒細(xì)胞的增生以及雌激素的合成和排卵. 目前, 研究者對(duì)禽類(lèi)FSHβ基因的研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性與產(chǎn)蛋量[7], 開(kāi)產(chǎn)日齡[8]等繁殖性能相關(guān). 楊山[9]的研究表明：給切除垂體的母禽注射垂體分泌的促卵泡激素制劑, 可以促進(jìn)已發(fā)生萎縮的卵泡繼續(xù)生長(zhǎng). 關(guān)于禽類(lèi)FSHβ基因與其繁殖性能的研究, 僅見(jiàn)于少數(shù)雞品種, 如：洪坤月等發(fā)現(xiàn)了太湖雞FSHβ基因具有多態(tài)性[10], 其5’調(diào)控區(qū)BB型的個(gè)體比AA型和AB型的個(gè)體產(chǎn)蛋量更高, 其B等位基因可能與產(chǎn)蛋性能有關(guān)系.

POU1F1 (Pituitary Specific Transcription Factor 1) 垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1是由垂體前葉特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子, 它通過(guò)與編碼垂體分泌激素GH、FSH、PRL、TSH和POU1F1自身的基因啟動(dòng)子結(jié)合, 調(diào)整垂體分泌激素的基因轉(zhuǎn)錄[11]. 此外, POU1F1直接影響動(dòng)物的生長(zhǎng), 繁殖等性狀. R. Jiang[12]等對(duì)雞POU1F1基因單核苷酸多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)：在POU1F1基因開(kāi)放閱讀框第980bp處存在一個(gè)突變位點(diǎn)由A突變?yōu)門(mén), 該突變位點(diǎn)導(dǎo)致編碼時(shí)由AAC-ATC, 造成天冬酰胺突變?yōu)楫惲涟彼? 并發(fā)現(xiàn)AA基因型與雞個(gè)體體重呈正相關(guān).

促卵泡素受體(FSHR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族, 存在于卵巢顆粒細(xì)胞膜上, 對(duì)動(dòng)物卵巢卵泡的發(fā)育、成熟和排卵具有重要的作用. 目前關(guān)于禽類(lèi)FSHR基因多態(tài)性的研究較少. 李亨等[13]對(duì)文昌雞FSHR基因的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)在文昌雞exon1-exon9和兩側(cè)內(nèi)含子區(qū)域上存在4個(gè)SNP位點(diǎn), 指出文昌雞exon8區(qū)的GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型, 可作為研究其繁殖性能的分子標(biāo)記. 楊玉 等[14]研究發(fā)現(xiàn)：適當(dāng)?shù)哪芰克娇梢蕴岣逨SHR mRNA的表達(dá), 進(jìn)而提高產(chǎn)蛋率. 但目前, 沒(méi)有藏雞繁殖調(diào)控軸及提高其繁殖性能的研究報(bào)道, 這不僅導(dǎo)致科技工作者和養(yǎng)殖業(yè)主無(wú)法獲得藏雞保護(hù)、選育和開(kāi)發(fā)的科學(xué)知識(shí)和指導(dǎo), 藏雞也因?yàn)槠浞敝承阅艿拖旅媾R被其他高產(chǎn)性能雞種淘汰的困境. 因此, 本研究以高產(chǎn)蛋量雞品種羅曼雞為對(duì)照, 研究藏雞FSHβ、POU1F1和FSHR三個(gè)基因的多態(tài)性,分析不同基因型與產(chǎn)蛋量的關(guān)系, 篩選出高產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型, 為保護(hù)藏雞遺傳多樣性、培育高產(chǎn)藏雞品種, 促進(jìn)藏雞規(guī)?；B(yǎng)殖提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分別從四川省甘孜州鄉(xiāng)城縣藏雞資源保種場(chǎng)和四川省原種雞場(chǎng)隨機(jī)選擇30只雌性純種藏雞(低產(chǎn)蛋量雞品種)和30只雌性羅曼雞(高產(chǎn)蛋量雞品種). 藏雞資源保種場(chǎng)每一只藏雞都來(lái)自不同的農(nóng)戶(hù)散養(yǎng)原種雞群, 30個(gè)個(gè)體之間無(wú)親緣關(guān)系. 然后進(jìn)行翼下靜脈采血, 枸櫞酸-枸櫞酸鈉-葡萄糖溶液(ACD)溶液抗凝2.0m/只, 血樣-70℃凍存, 帶回實(shí)驗(yàn)室提取DNA.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

取200μL混有抗凝劑的血液樣品, 依照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)于天根生化科技有限公司)的操作說(shuō)明步驟進(jìn)行提取. 將提取到的DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 最后成功提取DNA樣品,在-20℃保存.

1.2.2 PCR擴(kuò)增和DNA序列克隆及檢測(cè).

根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到的原雞的基因序列, 利用Primer Premier5生物軟件分別對(duì)FSHβ、POU1F1、FSHR設(shè)計(jì)B2,B3兩對(duì)、O3,O4,O5,O6四對(duì)、R1-R9九對(duì)引物, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增. DNA克?。?1)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化. (2)連接轉(zhuǎn)化DH5α菌株感受態(tài)細(xì)胞, 連接反應(yīng)的體系：pMD19-T Vector：0.5μL ; Solution I：5μL; 目的片段DNA：4.5μL; 共10μL體系, 加入2ml離心管中. 離心混勻, 16 ℃連接6h. (3)轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定, 送到上海Invitrogen生物技術(shù)公司測(cè)序. 采用鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)——非變性聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè). 引物序列及PCR反應(yīng)體系及程序見(jiàn)表1 和表2 .

表1 雞FSHβ亞基基因, POU1F1基因和FSHR基因的引物序列Table1 .Primer sequences of FSHβ gene, POU1F1 gene and FSHR gene in chicken

表2 雞FSHβ亞基基因, POU1F1基因和FSHR基因的引物PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序Table 2 The reaction system and Procedure of PCR amplification in FSHβ gene, POU1F1 gene and FSHR gene

1.2.3 應(yīng)用軟件

然后用DNAMAN5.0、Chro.exe進(jìn)行序列比對(duì)分析. 應(yīng)用Excel軟件計(jì)算單倍型頻率和基因型頻率,進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和加性顯性模型分析 . 采用Harding-Weinberg 平衡檢驗(yàn)、群體遺傳多樣性分析, 基因型獨(dú)立性檢驗(yàn)——χ2卡方獨(dú)立性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1FSHβ基因序列分析與多態(tài)性檢測(cè)

FSHβ亞基基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成, 除了非翻譯區(qū), 針對(duì)exon2和exon3設(shè)計(jì)的引物, 成功擴(kuò)增出目的條帶, 測(cè)序后拼接藏雞FSHβ基因exon2和exon3, 與NCBI上紅色原雞的相應(yīng)序列比對(duì)分析表明：藏雞與紅色原雞FSHβ基因CDS區(qū)序列的一致性為99.74%.

對(duì)藏雞和羅曼雞的FSHβ基因進(jìn)行SSCP檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)B2和B3引物擴(kuò)增出的片段在藏雞和羅曼雞上均僅具有一種基因型. 用序列對(duì)比軟件DNAMAN對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與PCR-SSCP電泳結(jié)果相一致,兩種雞含有相同的堿基序列.

2.2POU1F1基因序列分析與多態(tài)性檢測(cè)

禽類(lèi)POU1F1基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成, 其中exon3、exon4、exon5、exon6這4個(gè)外顯子則編碼POU1F1的POU結(jié)構(gòu)域. 針對(duì)這4個(gè)外顯子設(shè)計(jì)的引物, 成功擴(kuò)增出目的條帶, 測(cè)序后拼接藏雞POU1F1基因exon3、exon4、exon5、exon6, 與NCBI上紅色原雞的相應(yīng)序列做比較分析, 結(jié)果表明：藏雞與紅色原雞POU1F1基因部分CDS區(qū)序列的一致性為93.68%.

藏雞和羅曼雞的POU1F1基因的片段進(jìn)行SSCP檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)在藏雞該基因exon3上的基因型為AA基因型、羅曼雞為AB基因型, 藏雞該基因exon4的基因型為CC基因型、羅曼雞為CD基因型, 在藏雞和羅曼雞該基因exon5上均未表現(xiàn)出多種基因型, 藏雞該基因exon6上的基因型為T(mén)T基因型, 羅曼雞的基因型為T(mén)W基因型.

用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì). 發(fā)現(xiàn)：exon3上有3個(gè)SNP位點(diǎn), 藏雞AA基因型與羅曼雞AB基因型相比, 突變位臵分別位于exon3的20bp處T→C, 引起第107號(hào)氨基酸異亮氨酸(I)變?yōu)樘K氨酸(T); 第二處為第70bp處G→A, 引起第124號(hào)氨基酸丙氨酸(A)變?yōu)樘K氨酸(T); 第三處是第218bp處G→A, 此處為沉默突變.三處突變位點(diǎn)測(cè)序圖譜, 見(jiàn)圖1 exon4上第70bp處A→T, 引起第224號(hào)氨基酸酪氨酸(Y)變?yōu)楸奖彼?F); 突變位點(diǎn)測(cè)序圖譜見(jiàn)圖2. exon6上第127bp處T →C; 第263bp處T→C, 這兩處都為沉默突變, 測(cè)序圖譜見(jiàn)圖3.

圖1 引物O3擴(kuò)增產(chǎn)物不同帶型測(cè)序結(jié)果Fig 1 Sequence comparison for primer O3

圖2 引物O4擴(kuò)增產(chǎn)物不同帶型測(cè)序結(jié)果Fig 2 Sequence comparison for primer O4

圖3 引物O6擴(kuò)增產(chǎn)物不同帶型測(cè)序結(jié)果Fig 3 Sequence comparison for primer O6

基因頻率和基因型頻率分析見(jiàn)表3藏雞和羅曼雞在各自種內(nèi)僅具有單一基因型, 分析該基因exon3, 表明：AA基因型和AB基因型頻率一致, 但對(duì)藏雞和羅曼雞而言, 等位基因A為優(yōu)勢(shì)等位基因; 分析該基因exon4多態(tài)性表明：藏雞和羅曼雞的等位基因C為優(yōu)勢(shì)等位基因; 分析該基因exon6多態(tài)性發(fā)現(xiàn)：對(duì)藏雞和羅曼雞而言,等位基因T為優(yōu)勢(shì)等位基因. 經(jīng)過(guò)對(duì)基因型頻率的χ2檢驗(yàn)得出：三個(gè)外顯子上各基因型頻率和基因頻率在兩個(gè)種群中均處于非哈迪溫伯格平衡狀態(tài), 說(shuō)明該基因可能受到選擇的作用. 不同基因型與藏雞和羅曼雞產(chǎn)蛋量的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4POU1F1基因exon3、exon4、exon6獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：藏雞和羅曼雞的POU1F1基因的exon3、exon4、exon6序列核苷酸突變位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在兩個(gè)種群間呈極顯著性差異(P<0.01), 表明POU1F1基因在產(chǎn)蛋性能上可能發(fā)揮重要的作用.

表3 POU1F1基因在藏雞和羅曼雞上的基因型頻率和基因頻率Table3 Gene analysis of POU1F1gene in Tibetan chicken and Roman chicken

表4 藏雞和羅曼雞的POU1F1基因與產(chǎn)蛋量的相關(guān)分析Table 4 Relevance analysis of POU1F1 gene with egg production in Tibetan chicken and Roman chicken

2.3FSHR基因序列分析與多態(tài)性檢測(cè)

本研究首次克隆并測(cè)定了藏雞FSHR基因第1外顯子至第9外顯子序列, 測(cè)序后拼接藏雞FSHR基因exon1-exon9, 與NCBI上紅色原雞的相應(yīng)序列做比較分析表明：藏雞與紅色原雞FSHR基因CDS區(qū)序列的一致性為99.77%.

對(duì)藏雞和羅曼雞FSHR基因的片段進(jìn)行SSCP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：FSHR基因exon1上發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP位點(diǎn), 藏雞上的基因型為EE基因型, 羅曼雞的基因型為EF基因型. exon4上發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNP位點(diǎn), 藏雞種內(nèi)為三種不同基因型：GI、GH、HI基因型, 羅曼雞上僅表現(xiàn)為GH基因型.

用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì). 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：exon1上, 藏雞與羅曼雞比較, 突變位點(diǎn)于第103bp處C→T, 此處為沉默突變, 測(cè)序圖譜見(jiàn)圖4 Exon4上, 藏雞與羅曼雞比較, 藏雞第42bp處T→C, 引起第114號(hào)氨基酸甲硫氨酸(M)變?yōu)樘K氨酸(T); 第二處是第50bp處G→A, 引起第117號(hào)氨基酸甘氨酸(G)變?yōu)榻z氨酸(S), 測(cè)序圖譜見(jiàn)圖5.

圖4 引物R1擴(kuò)增產(chǎn)物不同帶型測(cè)序結(jié)果Fig 4 Sequence comparison for primer R1

圖5 引物R4擴(kuò)增產(chǎn)物不同帶型測(cè)序結(jié)果Fig 5 Sequence comparison for primer R4

基因頻率和基因型頻率分析見(jiàn)表5 EE基因型和EF基因型頻率一致, 但等位基因E為優(yōu)勢(shì)等位基因.FSHR基因exon4在藏雞中表現(xiàn)為3種基因型：GH、HI和GI基因型, 即具有種內(nèi)多態(tài)性. 在羅曼雞中僅表現(xiàn)為1種GH基因型. 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)藏雞而言, GI基因型為優(yōu)勢(shì)基因型, 等位基因I為優(yōu)勢(shì)等位基因, 因?yàn)镻IC值大于0.5, 證明該基因在藏雞上具有高度多態(tài)性(見(jiàn)表6). 經(jīng)過(guò)對(duì)基因型頻率的χ2檢驗(yàn)得出：各基因型頻率和基因頻率在兩個(gè)種群中均處于非哈迪溫伯格平衡狀態(tài), 說(shuō)明該基因可能受到選擇的作用. 藏雞和羅曼雞的FSHR基因exon1序列核苷酸突變位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率在兩個(gè)種群間呈極顯著性差異(P<0.01)這一結(jié)果表明：FSHR基因在產(chǎn)蛋性能上可能發(fā)揮重要的作用. 經(jīng)過(guò)對(duì)基因型頻率的χ2檢驗(yàn)得出：這三個(gè)基因型在藏雞種群中出于非哈迪溫伯格平衡狀態(tài), 說(shuō)明該基因可能受到選擇的作用. 不同基因型與藏雞產(chǎn)蛋量的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表7, 不同基因型與藏雞和羅曼雞產(chǎn)蛋量的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表8. 相關(guān)性分析表明：藏雞種群中FSHR基因在產(chǎn)蛋性能上可能發(fā)揮重要的作用. 另外, 藏雞種群內(nèi)GH基因型存在于高產(chǎn)蛋量個(gè)體上, 羅曼雞作為高繁殖性能雞的代表, 該基因也表現(xiàn)為GH基因型, 由此可以推斷：FSHR基因GH基因型可能是產(chǎn)蛋量的優(yōu)勢(shì)基因型.

表5 FSHR基因在藏雞和羅曼雞的基因型頻率和基因頻率Table5 Gene analysis of FSHR gene in Tibetan chicken and Roman chicken

表6 藏雞FSHR基因第4號(hào)外顯子基因型頻率和基因頻率Table6 Gene analysis of FSHR gene in Tibetan chicken

表7 藏雞FSHR基因R4位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)蛋量的相關(guān)分析Table 7 Relevance analysis of R4 site of FSHR gene with egg production in Tibetan chicken

表8 藏雞和羅曼雞的FSHR基因與產(chǎn)蛋量的相關(guān)分析Table 8 Relevance analysis of FSHR gene with egg production in Tibetan chicken and Roman chicken

3 討論

3.1FSHβ基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋量的關(guān)系

藏雞和羅曼雞的FSHβ基因CDS區(qū)exon2和exon3的核苷酸序列在種內(nèi)、種間均不具有多態(tài)性. 相應(yīng)片段在哺乳動(dòng)物[15-16]上檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn)：雖然FSHβ基因具有高保守性, 但禽類(lèi)與哺乳動(dòng)物在進(jìn)化上經(jīng)歷不同可能帶來(lái)差異.同樣, 洪坤月[17]等對(duì)綠殼蛋雞的FSHβ基因編碼區(qū)exon3的研究發(fā)現(xiàn)該片段具有多態(tài)性, 且AA基因型和AB基因型與開(kāi)產(chǎn)日齡顯著相關(guān), AA基因型蛋雞產(chǎn)蛋量顯著高于其他基因型蛋雞. 再者, 2008年韓厚明等[7]分析了文昌雞FSHβ基因多態(tài)性, 也在其5’調(diào)控區(qū)找到6個(gè)SNP位點(diǎn), 且證實(shí)這些SNPs位點(diǎn)與文昌雞早期產(chǎn)蛋性能具有顯著相關(guān)性, BB基因型為文昌雞的優(yōu)勢(shì)基因型, 攜帶有該基因型的個(gè)體開(kāi)產(chǎn)日齡早且產(chǎn)蛋量高. 然而, 趙興濤[18]等人對(duì)五龍鵝的FSHβ基因外顯子3個(gè)基因型的產(chǎn)蛋性狀之間差異性不顯著(P>0.05), 這一結(jié)果與我們的研究的結(jié)果相符合. 本研究結(jié)果出現(xiàn)的原因是：一方面我們只克隆了exon2和exon3, 發(fā)現(xiàn)藏雞和羅曼雞的這兩個(gè)外顯子在種內(nèi)、種間均不具有多態(tài)性, 我們無(wú)法推斷該基因其他外顯子序列是否在兩種雞之間存在差異; 另一方面, 我們也沒(méi)有分析藏雞FSHβ基因編碼區(qū)以外的調(diào)控區(qū)核苷酸序列. 因此, 將來(lái)需要對(duì)其余外顯子、編碼區(qū)以外的調(diào)控序列進(jìn)行研究, 并分析其與其繁殖性能間的關(guān)系, 從而獲得充分的分子證據(jù)分析該基因是否與藏雞產(chǎn)蛋性能存在必然相關(guān)性.

3.2POU1F1基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋量的關(guān)系

經(jīng)過(guò)χ2檢驗(yàn),POU1F1基因exon3上的2處核苷酸突變引起編碼氨基酸的改變, 基因型之間差異極顯著, AB基因型可能為產(chǎn)蛋量的優(yōu)勢(shì)基因型. 李國(guó)輝[19]等發(fā)現(xiàn)POUlFl基因exon3的突變(A5331T)基因型CC型與72周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān), CC基因型個(gè)體的產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于DD型、CD型個(gè)體(P<0.05), POUlFl基因?qū)?2周齡產(chǎn)蛋數(shù)表現(xiàn)為負(fù)的加性效應(yīng)和負(fù)的顯性效應(yīng). 胡玉萍[20]等研究發(fā)現(xiàn)：在POU1F1基因第三外顯子的5231bp位臵有A—T堿基的點(diǎn)突變, 其不同基因型顯著影響京海黃雞個(gè)周齡體重, 并推測(cè)POU1F1基因可能是影響雞生長(zhǎng)形狀的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標(biāo)記基因. 另有李國(guó)輝[21]指出,GH基因exon4(C2338GC2341T)的突變和

POU1F1基因exon3 的突變(A5331T)基因型CC 與白耳雞的72 周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05), 基因型AA、CC對(duì)產(chǎn)蛋數(shù)的加性效應(yīng)分別為3.80和3.57. 聚合基因型AACC 個(gè)體72 周齡產(chǎn)蛋數(shù)(除基因型ABCC 外)與對(duì)照組差異顯著(P<0.05). 因而, 上述這些相關(guān)研究成果證明禽類(lèi)的POU1F1基因多態(tài)性是與產(chǎn)蛋量顯著相關(guān)的, 本研究也說(shuō)明藏雞POU1F1基因exon3上的2處核苷酸突變引起編碼氨基酸的改變與產(chǎn)蛋量顯著相關(guān).

在我們所查閱的資料范圍內(nèi),POU1F1基因exon4上的突變位點(diǎn)在禽類(lèi)上是首次發(fā)現(xiàn), 之前未有相關(guān)報(bào)道.這些突變引起的氨基酸改變, 基因型之間差異極顯著, 且其CD基因型可能為產(chǎn)蛋量的優(yōu)勢(shì)基因型. 藏雞與羅曼雞相比,POU1F1基因exon6上存在2個(gè)核苷酸突變位點(diǎn), 基因型之間差異極顯著, 其TW基因型可能為高產(chǎn)蛋量基因型. R. Jiang[12]等對(duì)雞POU1F1基因單核苷酸多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)AA基因型與雞個(gè)體體重呈正相關(guān), 而體重又是影響蛋雞產(chǎn)蛋率的重要因素, 廉婷[22]等對(duì)二郎山山地雞研究證明：達(dá)到 300 日齡時(shí)大體重組的總產(chǎn)蛋數(shù)極顯著高于中、 小體重組(P<0.01), 這也能說(shuō)明雞的POU1F1基因會(huì)影響產(chǎn)蛋性能. 這與本研究的結(jié)果相符. 在本研究中, 雖然藏雞此片段的核苷酸突變未引起所編碼的氨基酸序列的改變, 但該基因核苷酸序列已發(fā)生變化,由此可能會(huì)影響到POU1F1基因后續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯中序列剪接和修飾的過(guò)程, 進(jìn)而影響該基因表達(dá), 導(dǎo)致藏雞和羅曼雞種群間的產(chǎn)蛋量存在差異.

3.3 FSHR基因多態(tài)性及其與產(chǎn)蛋量的關(guān)系

本研究中FSHR基因exon1在藏雞和羅曼雞種群間存在1個(gè)SNP位點(diǎn), 該多態(tài)性位點(diǎn)位于FSHR基因exon1上前端第103bp處, 經(jīng)獨(dú)立性檢發(fā)現(xiàn)EF基因型與EE基因型頻率差異極顯著. 康麗[23]等人發(fā)現(xiàn)雞FSHR基因5’調(diào)控區(qū)兩個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)開(kāi)產(chǎn)日齡影響顯著. 本研究突變堿基位于FSHR基因exon1上前端第103bp處, 該突變位點(diǎn)靠近基因編碼調(diào)控區(qū), 可能會(huì)影響FSHR編碼過(guò)程中的調(diào)控, 導(dǎo)致表型差異, 表現(xiàn)為藏雞較羅曼雞產(chǎn)蛋量更低.

FSHR基因exon4序列在藏雞種群內(nèi)存在2個(gè)SNP位點(diǎn), 表現(xiàn)為3種基因型(GH, GI, HI), 而在羅曼雞上僅具有一種基因型(GH), 且羅曼雞的基因型與藏雞種群內(nèi)的一種相同, 經(jīng)檢驗(yàn)這2個(gè)SNP位點(diǎn)引起的氨基酸突變與藏雞產(chǎn)蛋量具有極顯著相關(guān)性. 這與李亨等[13]對(duì)文昌雞FSHR基因的多態(tài)性研究結(jié)果相似, 他們發(fā)現(xiàn)在文昌雞exon1-exon9和兩側(cè)內(nèi)含子區(qū)域上存在4個(gè)SNP位點(diǎn), 分別為： exon2區(qū)域的內(nèi)含子1中C-T; exon4區(qū)域43bp處T-C; exon6區(qū)域內(nèi)含子7中A-G; exon8區(qū)域內(nèi)含子9中G-T, 指出文昌雞exon8區(qū)的GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型, 可作為研究其繁殖性能的分子標(biāo)記. 相關(guān)性分析表明：藏雞種群中FSHR基因的三種基因型在產(chǎn)蛋性能上可能發(fā)揮重要的作用. 藏雞的GH基因型較GI基因型和HI基因都具有更高產(chǎn)蛋量. 另外, 羅曼雞作為高繁殖性能雞的代表, 該基因也表現(xiàn)為GH基因型, 由此進(jìn)一步說(shuō)明：FSHR基因GH基因型是決定產(chǎn)蛋量的優(yōu)勢(shì)基因型. 因此,FSHR基因exon4多態(tài)性可能與禽類(lèi)產(chǎn)蛋量呈極顯著相關(guān)性, 且GH基因可能是控制禽類(lèi)個(gè)體高產(chǎn)蛋量的有效基因型.

此外, 楊玉[14]等研究發(fā)現(xiàn)日糧能量對(duì)性成熟的作用可能與影響FSHRmRNA表達(dá)進(jìn)而影響卵巢卵泡的發(fā)育有關(guān); 適當(dāng)?shù)哪芰克娇梢蕴岣逨SHRmRNA的表達(dá), 蛋雞22周齡卵巢FSHR mRNA的表達(dá)量可能成為其后產(chǎn)蛋量高低的預(yù)示指標(biāo). 王克華[24]等已經(jīng)研究證明,FSHR基因與蛋重、產(chǎn)蛋數(shù)、開(kāi)產(chǎn)日齡等重要繁殖性能密切相關(guān), 表明FSHR基因有望成為選育高產(chǎn)蛋雞的分子標(biāo)記. 我們?nèi)拥牧_曼雞來(lái)自原種場(chǎng), 用配合飼料實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖, 能量充足, 而藏雞來(lái)自保種場(chǎng), 該保種場(chǎng)實(shí)行野外放養(yǎng)和半補(bǔ)飼相結(jié)合, 其食物構(gòu)成復(fù)雜, 這也可能造成產(chǎn)蛋量的變化, 但是從藏雞主產(chǎn)區(qū)多年的調(diào)查表明藏雞的產(chǎn)蛋量一直都很低. 由此我們推論：FSHR基因多態(tài)性與藏雞產(chǎn)蛋量顯著相關(guān), 只是還需要考慮更多的相關(guān)因子, 才能更準(zhǔn)確地揭示它們之間的關(guān)系.

4 結(jié)論

(1) 低產(chǎn)蛋量的藏雞和高產(chǎn)蛋量的羅曼雞在促卵泡激素基因β亞基(FSHβ)CDS區(qū), 都不存在SNP位點(diǎn). 無(wú)法推斷藏雞FSHβ基因是否與其繁殖性狀相關(guān).

(2) 藏雞和羅曼雞在垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1(POU1F1)基因的exon3, exon4和exon6上存在6個(gè)SNP位點(diǎn), 并

引起相應(yīng)編碼氨基酸種類(lèi)的改變, exon3上的AA和AB基因型之間、exon4上的CC和CD基因型之間以及exon6上的TT和TW基因型之間差異顯著, 其中AB, CD和TW基因型是優(yōu)勢(shì)基因型, 可作為高產(chǎn)遺傳標(biāo)記. 由此我們推論：藏雞POU1F1基因的多態(tài)性與產(chǎn)蛋量呈極顯著相關(guān)性, 而POU1F1基因可能是影響其產(chǎn)蛋量的主效基因.

(3) 藏雞和羅曼雞在促卵泡激素受體(FSHR)基因的exon1和exon4上共有3個(gè)SNP位點(diǎn)并引起了2處氨基酸種類(lèi)改變, exon1上的EE和EF基因型之間、exon4上的GH、GI和HI基因型之間差異顯著, GH基因型為藏雞產(chǎn)蛋性能的優(yōu)勢(shì)基因型, 可作為研究藏雞種群產(chǎn)蛋量的遺傳標(biāo)記. 相關(guān)性分析表明藏雞FSHR基因多態(tài)性與其產(chǎn)蛋量呈極顯著相關(guān)性. 但鑒于影響繁殖性能的因素較多, 將來(lái)我們不僅要從整個(gè)調(diào)控軸的基因外顯子, 甚至內(nèi)含子以及其他環(huán)境因素結(jié)合起來(lái)研究, 為更加科學(xué)地揭示藏雞繁殖調(diào)控機(jī)理、篩選高繁殖性能的藏雞提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo).

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The relationship between polymorphism of FSHβ, POU1F1, FSHR gene and egg production traits in Tibetan chickens

YANG Kong1,2, YANG Ai-lin1,2, WU Meng-ling1,2
（1. Key Laboratory for Qing?Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Conservation and Exploitation of Sichuan Province, Chengdu
610041, P.R.C.; 2. The Tibetan Plateau Research Institute, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.）

This paper explores the association of polymorphism of FSHβ, POU1F1, FSHR gene with egg production traits in Tibetan chickens, and analyses the poor performances of their egg-laying reasons at the molecular level to filter out the high-product genotypes to help breed the high-product Tibetan chicken, and to provide theoretical basis and guidance to protect purebred Tibetan chickens and promote large-scale cultivation. This research takes the Roman chicken as control who has high level of egg-laying. Follicular stimulating hormone beta subunit gene(FSHβ), pituitary-specific transcription factor 1gene (POU1F1) and foliole-stimulating hormone receptor gene(FSHR) are selected which are in the chicken’s reproduction manipulation axis, and then these three gene coding regions (CDS) of single nucleotide polymorphism (SNP) are cloned and its relationship with Tibetan chicken egg production is analyzed. There is no intraspecific and interspecific polymorphism in exon2 and exon3 ofFSHβbetween Tibetan chickens and Roman chickens, expressed as a single genotype. There are SNP loci in exon3, exon4, exon6 of POU1F1 between Tibetan chickens and Roman chickens, with their own unique genotype. In exon3, Tibetan chickens own AA genotype and Roman chickens own AB genotype; in exon4, Tibetan chickens own CC genotype and Roman chickens own CD genotype; in exon6,Tibetan chickens own TT genotype and Roman chickens own TW genotype. But the exon5 in the two species demonstrates none of the intraspecific and interspecific polymorphisms. There are SNP loci in exon1, exon4 of FSHR between Tibetan chickens and Roman chickens. In exon1, Tibetan chickens own EE genotype and Roman chickens own EF genotype; in exon4 , Tibetan chickens show 3 genotypes (GH, GI, HI), and Roman chicken has only one genotype (GH), and Roman chicken and Tibetan chicken own the GH genotype within the same.FSHβgenes have no polymorphisms, and its relationship with egg production needs some further research. Exon3, exon4 and exon6 of POU1F1 have polymorphisms. The allele frequency and genotype frequency of these three loci reach extremely significant level (P<0.01), indicating that this six SNP loci are significantly associated with Tibetan chicken egg production. Exon1 and exon4 of FSHR have polymorphisms. The allele frequency and genotype frequency of these loci reach extremely significant level(P<0.01), speculating that the gene SNP and egg production have significant relevance.

Tibetan chicken; FSHβ; POU1F1; FSHR; polymorphism; egg production trait

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.01.01

S831.2

A

1003-4271(2014)01-0001-10

2013-12-09

楊孔(1973-), 男, 教授, Email：lx-yk@163.com. #為同等貢獻(xiàn)作者.

四川省青年基金(08ZQ026-027); 西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)基金(2011XWD-S071012); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)“優(yōu)秀學(xué)生培養(yǎng)工程”項(xiàng)目(12ZYXS68); “優(yōu)秀科研團(tuán)隊(duì)及重大孵化項(xiàng)目”(13NZYTD01); 國(guó)家人事部留學(xué)歸國(guó)人員擇優(yōu)資助項(xiàng)目; 國(guó)家外國(guó)專(zhuān)家局外專(zhuān)項(xiàng)目(2012-21, 2013-23)