乳酸菌蛋白降解及產(chǎn)香能力分析

蘇媛寧，夏玉，林捷*，張錦鵬，張歡歡，曾繁祥，張俊華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510600）

乳酸菌蛋白降解及產(chǎn)香能力分析

蘇媛寧，夏玉，林捷*，張錦鵬，張歡歡，曾繁祥，張俊華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510600）

研究了分離自新疆酸奶疙瘩中6株乳酸菌在37℃下蛋白質(zhì)降解和產(chǎn)香能力。結(jié)果表明，6株乳酸菌穩(wěn)定期活菌數(shù)均在108CFU/mL以上，且凝乳細(xì)膩，具有良好的組織狀態(tài)。各菌株發(fā)酵性能有差異，干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、乳脂乳球菌3株菌發(fā)酵性能較植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌發(fā)酵性能優(yōu)，可用于不同風(fēng)味和功能的發(fā)酵乳制品生產(chǎn)。其中，干酪乳桿菌具有良好的蛋白水解力，發(fā)酵15h，酪氨酸含量為594.33μg/mL；乳脂乳球菌產(chǎn)香性能好，發(fā)酵24h，丁二酮含量為12.32μg/mL、乙醛含量為59.27μg/mL，與其他菌株具有顯著差異；瑞士乳桿菌具有強(qiáng)的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏特性，發(fā)酵24h，酸度達(dá)159.76°T，黏度值1 389mPa·s。

乳酸菌；蛋白降解；丁二酮；乙醛

酸奶的風(fēng)味與品質(zhì)很大程度上取決于乳酸菌發(fā)酵劑[1]。風(fēng)味良好，口感細(xì)滑，富含功能性多肽、具有保健功能的酸奶已經(jīng)成為乳制品行業(yè)研究的熱點(diǎn)。乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸、醋酸和醛、酮、醇、胞外多糖等物質(zhì)，對(duì)酸奶的質(zhì)地、風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)功能起著至關(guān)重要的作用[2-3]。另外，乳酸菌在發(fā)酵過程中能夠水解乳蛋白生成小分子多肽，具有調(diào)節(jié)人體生理功能的功效[4-6]。在新疆傳統(tǒng)乳制品酸奶疙瘩中分離出6株乳酸菌，經(jīng)鑒定分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳脂乳球菌（Lactococcus lactis cremoris）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。通過對(duì)6株乳酸菌發(fā)酵性能的測(cè)定，期望得到適合生產(chǎn)老酸奶的菌株。實(shí)驗(yàn)對(duì)6株野生乳酸菌的活菌數(shù)、產(chǎn)酸、產(chǎn)香、蛋白降解能力等方面進(jìn)行研究對(duì)比，為開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，性能優(yōu)良的發(fā)酵劑提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），簡(jiǎn)稱Lp；乳脂乳球菌（Lactococcus lactis cremoris），簡(jiǎn)稱Ls；嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），簡(jiǎn)稱St；保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus），簡(jiǎn)稱Lb；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），簡(jiǎn)稱Lc；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），簡(jiǎn)稱Lh。以上菌種均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

脫脂乳粉（蛋白質(zhì)≥30%）：新西蘭安佳。

鄰苯二甲醛：天津市大茂化學(xué)試劑廠；丁二酮：天津市福晨化學(xué)試劑廠；三氯乙酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；碘：廣州化學(xué)試劑廠；碘化鉀：上海銀典化工有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HG303-5恒溫培養(yǎng)箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；pHs-2F型pH計(jì)：上海精科儀器有限公司；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DL-5低速大容量離心機(jī)：上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司；UVmin-1240型分光光度計(jì)：島津儀器有限公司；SNB-1型黏度計(jì)：上海方瑞儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備工藝流程

脫脂乳粉復(fù)水（12%，w/v）→45℃水合30min→巴氏殺菌（85℃，5min）→冷卻至40℃→接種3%活化單菌種→37℃恒溫發(fā)酵→每3h取樣，測(cè)定指標(biāo)。

1.3.2 pH與滴定酸度的測(cè)定方法

采用精密pH計(jì)于室溫條件下測(cè)定試樣pH。滴定酸度按照GB5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定》方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 活乳酸菌菌落數(shù)的測(cè)定

活乳酸菌菌落數(shù)的測(cè)定按照GB 4789.35—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 黏度的測(cè)定

采用黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 乙醛含量的測(cè)定

取適量試樣，與16%（w/v）三氯乙酸等體積混勻，靜置10min，3 500r/min離心10min，取上清液用濾紙過濾。取濾液25mL于碘量瓶中，加入1%NaHSO3溶液5mL，搖勻，暗處放置1h。加入淀粉指示劑1mL，用0.1mol/L碘液滴定至接近無(wú)色，再改用0.01mol/L碘溶液滴定淡藍(lán)色出現(xiàn)。加入1mol/L的NaHCO3溶液20mL，振蕩混勻，用0.01mol/L碘標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色再次出現(xiàn)，記錄消耗的碘液的體積[7]。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)，平行3次。乙醛含量的計(jì)算公式：

式中：V1為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，mL；V2為空白實(shí)驗(yàn)碘標(biāo)準(zhǔn)溶液用量，mL；C為碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；25為乙醛樣品稱樣量，mL；0.022為乙醛化學(xué)反應(yīng)基本單元，g/mol。

1.3.6 丁二酮含量的測(cè)定

丁二酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用微量進(jìn)樣器吸取15μL丁二酮標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至500mL。取12支編號(hào)的試管分成2排放置，用蒸餾水準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度分別為0.0﹑3.0μg/mL﹑6.0μg/mL﹑9.0μg/mL﹑12.0μg/mL﹑15.0μg/mL丁二酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10mL樣液，第一排試管中加入1%鄰苯二胺溶液0.5mL，第二排試管不加為空白；搖勻后置于黑暗處放置30min。后加入4.0mol/L鹽酸終止反應(yīng)，第一排試管加2.0mL，第二排試管加2.5mL，混勻后以第二排試管空白作為參比液，在波長(zhǎng)335nm處測(cè)定吸光度值。做3個(gè)平行取平均值，以丁二酮質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.097 8x-0.015 9，相關(guān)系數(shù)r2=0.998 6。

樣品丁二酮含量測(cè)定：樣品處理同1.3.5方法，濾紙過濾得上清液。取樣液20mL置于50mL錐形瓶中，按上述丁二酮標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定吸光度值。然后查丁二酮標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得待測(cè)樣品中丁二酮質(zhì)量濃度[7-8]。

1.3.7 蛋白水解力的測(cè)定

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用蒸餾水準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度分別為0、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的酪氨酸溶液。用移液槍分別移取150μL不同質(zhì)量濃度的酪氨酸溶液，加入3mL鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）試劑[9]，混勻后室溫條件下反應(yīng)2min，在波長(zhǎng)340nm處測(cè)定吸光度值。平行3次取平均值，以酪氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.001x-0.009，相關(guān)系數(shù)r2=0.998。

樣品測(cè)定[10]：吸取2.5mL的發(fā)酵乳于試管中，加入0.5mL蒸餾水，再加入0.75mol/L的三氯乙酸5mL，混勻，室溫靜置10min后，4000r/min離心5min。取上清液測(cè)定吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相當(dāng)于酪氨酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 各菌株的產(chǎn)酸特性

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵過程中酸度(A)及pH值(B)變化曲線Fig.1 Change of acidity(A)and pH(B)during fermentation by different lactic acid bacteria

由圖1可知，各乳酸菌的產(chǎn)酸能力有一定的差異。發(fā)酵過程中，滴定酸度整體呈上升趨勢(shì)，pH隨時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵后期均趨于平穩(wěn)。Lh產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，發(fā)酵24h滴定酸度為159.77°T；Ls前期產(chǎn)酸速率較快，12h以后酸度緩慢上升，這與球菌生長(zhǎng)速度快，屬于先產(chǎn)酸類型相關(guān)[11]；發(fā)酵18h后，酸度增長(zhǎng)趨于平緩，發(fā)酵后期，過高的酸度抑制活菌數(shù)的增長(zhǎng)。但Lh與Ls在發(fā)酵乳的pH降至3.5左右仍能生長(zhǎng)，說(shuō)明2菌株具有強(qiáng)耐酸性，有利于腸道定植益生菌的開發(fā)。

2.2 各菌株的產(chǎn)香特性

乙醛和雙乙酰是酸奶中主要的風(fēng)味物質(zhì)。由圖2可知，乳酸菌的產(chǎn)乙醛和丁二酮含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，含量逐漸上升，發(fā)酵后期，含量基本穩(wěn)定，但菌種間存在差異。Ls菌株產(chǎn)香能力最強(qiáng)，發(fā)酵24h，乙醛含量可達(dá)59.27μg/mL，丁二酮含量為12.31μg/mL，與其他菌種存在顯著性差異（P<0.05）。Lb產(chǎn)香性能較強(qiáng)，發(fā)酵24h，丁二酮產(chǎn)生量為8.19μg/mL。丁二酮的產(chǎn)生與pH和菌種的活力有關(guān)[12]，當(dāng)pH下降至4.5左右，有大量的丁二酮開始積累，在發(fā)酵后期，由于菌種處于穩(wěn)定及衰亡期，代謝活力較低和丁二酮的集聚，丁二酮含量保持在相對(duì)高且穩(wěn)定的狀態(tài)中。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵過程中丁二酮含量(A)及乙醛含量(B)變化曲線Fig.2 Change of butanedione content(A)and acetaldehyde content (B)during fermentation by different lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌的產(chǎn)黏特性

發(fā)酵乳的質(zhì)地與胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）產(chǎn)生密切相關(guān)，王亞峰等[13]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胞外多糖乳酸菌能夠提高發(fā)酵乳的黏度，減少乳清的析出，有助于改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)和黏稠度。由圖3可知，6株乳酸菌的產(chǎn)黏性趨勢(shì)一致，發(fā)酵9h，凝乳時(shí)黏度顯著上升，后期黏度趨于平緩，個(gè)別略有下降，可能與乳清析出相關(guān)。瑞士乳桿菌發(fā)酵乳黏稠性最好，發(fā)酵12h后黏度均達(dá)到1 369mPa·s。發(fā)酵24h，各乳酸菌的產(chǎn)黏特性的大?。篖h>Lc>Lb>Ls>Lp>St，且球菌的產(chǎn)黏能力普遍低于桿菌，這主要由于球菌生成乳酸速度過快，乳酸通過抑制乳酸脫氫酶的活性，從而抑制糖代謝，影響菌體的生長(zhǎng)，胞外多糖產(chǎn)生量減少[14]。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵過程中黏度變化曲線Fig.3 Change of viscosity during fermentation by different lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌活菌數(shù)增殖速度

由圖4可知，各乳酸菌發(fā)酵3h，已進(jìn)入對(duì)數(shù)期；穩(wěn)定期出現(xiàn)在12～18h之間，隨后活菌數(shù)開始呈下降趨勢(shì)。其中，Ls的活菌數(shù)一直保持較高的水平，發(fā)酵18h活菌數(shù)達(dá)到峰值1010CFU/mL；Lh、Lc、Lb和Lp的菌數(shù)差異不顯著，穩(wěn)定期菌數(shù)保持在109CFU/mL左右；St整個(gè)過程中，相對(duì)其他菌株，活菌數(shù)一直處于較低水平，發(fā)酵15h，活菌數(shù)低于108CFU/mL。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化曲線Fig.4 Change of viable bacteria during fermentation by different lactic acid bacteria

2.5 蛋白質(zhì)水解能力

乳酸菌不能直接利用外源蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)氮源，必須通過水解外源蛋白質(zhì)或肽，提供菌體正常生長(zhǎng)代謝對(duì)氨基酸的需要[15]，蛋白水解力的強(qiáng)弱與菌株的酶系相關(guān)[16]，影響菌體的正常生長(zhǎng)。另外，適度的蛋白水解對(duì)改善制品風(fēng)味以及生成活性多肽，具有重要作用。

由圖5可知，在發(fā)酵12h前，各菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酪氨酸呈曲折增長(zhǎng)趨勢(shì)。從乳酸菌的生長(zhǎng)曲線可以看出，這個(gè)時(shí)期乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力高，蛋白的水解能力強(qiáng)。Lc菌株蛋白水解能力最強(qiáng)，發(fā)酵15h，酪氨酸含量為594.33μg/mL；姜瞻梅等[17]研究中，篩選出具有強(qiáng)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin convertingenzyme，ACE）抑制活性與蛋白水解能力的菌株主要為瑞士乳桿菌。本實(shí)驗(yàn)中，瑞士乳桿菌發(fā)酵24h時(shí)，酪氨酸含量達(dá)383.5μg/mL，具有較好的蛋白水解能力，而St、Lp、Lb菌株對(duì)蛋白的降解能力保持在較低水平。

實(shí)驗(yàn)中生長(zhǎng)力較強(qiáng)的菌株與蛋白水解力不呈正相關(guān)，說(shuō)明菌株蛋白水解力高低與生長(zhǎng)快慢并沒有必然聯(lián)系。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵過程中酪氨酸含量變化曲線Fig.5 Change of tyrosine content during fermentation by different lactic acid bacteria

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中6株乳酸菌發(fā)酵脫脂乳，均具有良好的凝乳狀態(tài)，但各菌株在產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏性能，以及對(duì)蛋白的降解能力上存在顯著差異。嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌與植物乳桿菌在各方面性能表現(xiàn)較低水平。瑞士乳桿菌具有良好的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏能力，發(fā)酵24h，酸度達(dá)159.76°T，黏度值1389mPa·s。干酪乳桿菌具有強(qiáng)的蛋白水解能力，發(fā)酵15h，酪氨酸最高達(dá)594.33μg/mL，乳脂乳球菌產(chǎn)香性能最好，丁二酮、乙醛產(chǎn)生量顯著高于其他菌株。綜合各指標(biāo)比較，瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、乳脂乳球菌發(fā)酵性能優(yōu)，各有特色，適用于良好風(fēng)味、富含活性多肽的功能性發(fā)酵乳制品開發(fā)，并提供了較全面的理論依據(jù)。

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Analysis of protein degradation and aroma-producing capacity of lactic acid bacteria

SU Yuanning,XIA Yu,LIN Jie*,ZHANG Jinpeng,ZHANG Huanhuan,ZENG Fanxiang,ZHANG Junhua
(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510600,China)

Protein degradation and aroma-producing ability of six lactic acid bacteria strains isolated from yogurt pimple were determined in skimmed milk at 37℃.The result showed that the viable bacteria of six lactic acid bacteria was up to 108CFU/ml in stable phase and the curd was smooth with good organization state.The fermentation performance of each strain was different.The characteristics ofLactobacillus casei,Lactobacillus helveticus,Lactococcus cremoriswere better than other stains includingLactobacillus plantarum,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus.The strains can be applied in fermented dairy products with unique flavor and special functions.L caseihad high hydrolysis efficiency and the tyrosine content was 594.33 μg/ml after incubation for 15 h.The aroma producing characteristic ofL.cremoriswas good,the content of butanedione was 12.32 μg/mL and the acetaldehyde content was 59.27 μg/mL after fermentation for 24 h,showing a significant difference with other strains.L.helveticusbehaved obvious characteristic of acidity and viscidity,the acidity reached 159.76°T and viscosity reached 1 389 mPa·s after fermentation for 24 h.

lactic acid bacteria;protein degradation;butanedione;acetaldehyde

TS252.1

A

0254-5071（2014）03-0036-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.010

2014-01-20

廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012B010300019）；2012年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（1056412143）

蘇媛寧（1991-），女，本科生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。

*通訊作者：林捷（1966-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物與食品質(zhì)量與安全控制。