重組大腸桿菌產(chǎn)青霉素?；傅陌l(fā)酵動力學(xué)研究

韋曉菊，黎繼烈*，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院經(jīng)濟森林培育與保護教育重點實驗室，湖南長沙410004）

重組大腸桿菌產(chǎn)青霉素?；傅陌l(fā)酵動力學(xué)研究

韋曉菊，黎繼烈*，朱曉媛

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院經(jīng)濟森林培育與保護教育重點實驗室，湖南長沙410004）

對產(chǎn)青霉素酰化酶重組大腸桿菌M3進行分批發(fā)酵動力學(xué)研究。根據(jù)Logistic和Luedeking-Piret方程，擬合出重組大腸桿菌M3

青霉素酰化酶；分批發(fā)酵；發(fā)酵動力學(xué)模型

青霉素?；福╬enicillinacylase）是一種具有重要應(yīng)用價值的工具酶，既能廣泛應(yīng)用于半合成β-內(nèi)酰胺抗生素，又能反向催化水解青霉素，生產(chǎn)合成β-內(nèi)酰胺抗生素的中間體6-氨基頭孢烷酸（6-amino-cephalosporanicacid，6-ACA）和7-氨基脫乙酰頭孢烷酸（7-amino desacetoxy cephalosporanic acid，7-ADCA）；同時在手性藥物的拆分和多肽合成等方面也有不俗表現(xiàn)[1-5]。近年來抗生素生產(chǎn)市場已形成以DSM-GB公司為首（約占34%），中國、印度、韓國等亞洲公司（約25%）和荷蘭Duchefa Biochemie B.V.公司（約18%）、上海Antibioticos國際貿(mào)易有限公司（約10%）等歐美公司并存的格局[6-7]。在市場需求的催生下，工藝流程簡單，反應(yīng)條件溫和，清潔無污染的酶法合成抗生素應(yīng)運而生。目前，青霉素?；复俸铣搔?內(nèi)酰胺抗生素及制備6-ACA等中間體的新工藝和新技術(shù)不斷涌現(xiàn)[8-10]，使綠色環(huán)保的酶法合成抗生素替代化學(xué)法得以大規(guī)模推廣，必將對抗生素產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生深遠影響。

發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物生成、基質(zhì)消耗的動態(tài)平衡及其內(nèi)在規(guī)律構(gòu)成的動力學(xué)模型即為發(fā)酵動力學(xué)模型的3個組成部分[11]。因而建立重組大腸桿菌產(chǎn)青霉素酰化酶的動力學(xué)模型，并對發(fā)酵過程的數(shù)據(jù)進行分析能更好的認識菌體的生長及產(chǎn)物形成的機制，為進一步放大實驗以及工業(yè)化優(yōu)化與調(diào)控提供理論依據(jù)。且重組大腸桿菌發(fā)酵原料廉價，產(chǎn)酶周期短[12]，既適合多次重復(fù)驗證試驗以得出最優(yōu)結(jié)果，又為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了便利。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌M3：本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，氯化鈉1.0%，pH 7.0。121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，氯化鈉1.0%，甘油2.0%，卡那霉素50μg/mL，泡敵0.05%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

蛋白胨（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；酵母浸粉（分析純）：上海研生生化試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；甘油（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；卡那霉素（分析純）：鵬程生物技術(shù)有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（優(yōu)級純）：上海勵瑞生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

B型SL5L全自動控制發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SZK-730紫外可見分光光度計：深圳歐克儀表科技有限公司；S-250D型超聲波細胞破碎儀：美國Branson公司；AvantiJ-E高速冷凍離心機：美國BeckmanCoulter公司。1.3實驗方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

每瓶50mL分裝于250mL，錐形瓶中，滅菌后加入100μg/mL卡那霉素，接入甘油保藏菌液，在30℃、160r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h。

1.3.2 分批發(fā)酵過程

分批發(fā)酵采用5L發(fā)酵罐，裝料系數(shù)0.6，即加入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃實罐滅菌20min，冷卻至30℃后接入100mL種子液。發(fā)酵過程中，保持罐內(nèi)壓為0.02～0.03MPa之間，并使用溶氧電極和pH電極實時監(jiān)測溶氧和pH的變化情況。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使溶氧保持在20%～60%。培養(yǎng)至10h，測定菌體濃度，降溫至24℃，加入30μg/mL異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）進行誘導(dǎo)。

1.3.3 發(fā)酵過程中參數(shù)的測定

菌體濃度的測定：采用濕重法。取發(fā)酵液1mL用高速離心機離心10min棄上清液稱質(zhì)量，減去離心管的質(zhì)量并求得菌體濕質(zhì)量。

青霉素?；该富畹亩x：在37℃時，單位體積的青霉素?；冈趩挝粫r間內(nèi)催化青霉素鉀鹽水解生成1μmol的6-APA所需的酶量定義為1個活力單位，U/L。根據(jù)定義采用堿滴定法[13]測定酶活力。

甘油含量的測定：用甘油銅比色法[14]。

1.3.4 數(shù)據(jù)的獲取及處理

從發(fā)酵開始計時取樣，再每3h取樣測定不同時期的菌體濕質(zhì)量、青霉素?；该富盍σ约案视蜐舛?，以上實驗每組做3次平行實驗，取平均值，并用Origin 8.0繪圖軟件對動力學(xué)方程進行非線性擬合，繪制動力曲線，以獲得最佳動力學(xué)模型參數(shù)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌產(chǎn)青霉素?；赴l(fā)酵過程中代謝變化規(guī)律

重組大腸桿菌M3代謝變化特征如圖1所示。由圖1可知，該菌體生長延遲期為0～3h，在該階段菌體基質(zhì)消耗較少，菌體濃度增長不明顯，青霉素?；府a(chǎn)量為零。進入對數(shù)期后，菌體生長加快，基質(zhì)消耗增加，甘油含量顯著下降，青霉素?；府a(chǎn)量也隨之增長。進入穩(wěn)定期后菌體濕質(zhì)量幾乎不再增長，甘油消耗量也逐漸減少，但青霉素?；该富盍Τ掷m(xù)升高，酶活力在27h時達到最高值33.5U/mL，由此判斷該菌種產(chǎn)的青霉素?；傅暮铣煞绞綄儆谏L部分偶聯(lián)型。

圖1 重組大腸桿菌M3產(chǎn)青霉素?；赴l(fā)酵進程曲線Fig.1 Fermentation curve of penicillin acylase produced by Escherichia coliM3

2.2 動力學(xué)模型

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型

細胞生長動力學(xué)普遍使用Logistic方程，其能較好描述分批發(fā)酵過程中因菌體濃度的增加對菌體自身存在的抑制作用。該方程被看作是一個表現(xiàn)細胞生長于營養(yǎng)物質(zhì)之間非線性關(guān)系的經(jīng)驗方程[16-17]。本實驗中大腸桿菌的生長曲線為較標準的S型，故采用Logistic方程作為研究重組大腸桿菌M3的菌體生長動力學(xué)模型。

Logistic方程：

式中：X為菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h。

將式（1）積分為代數(shù)方程：

式中：X為菌體濃度，mg/L；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h。

參照公式（2），使用Origin 8.0繪圖軟件對菌體生長實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌體生長的試驗值與模型計算值的比較Fig.2 Comparison of experimental data with calculated data on cell growth

菌體濕質(zhì)量（X）隨發(fā)酵時間變化的函數(shù)為：

式中：X為菌體濃度，mg/L；μm=0.224 42，X0=7.604 27mg/L，Xm=41.751 49mg/L；t為發(fā)酵時間，h。

由圖2可知，實驗數(shù)據(jù)與公式（3）的計算值基本吻合，R2=0.995 5，結(jié)果表明實驗值與動力學(xué)模型基本相符，因而大腸桿菌產(chǎn)青霉素?；竷?yōu)化調(diào)控可參考依據(jù)該動力學(xué)模型。

2.2.2 青霉素?；负铣蓜恿W(xué)模型

由于微生物在發(fā)酵的動態(tài)過程中細胞內(nèi)的生物具有十分復(fù)雜的合成途徑，且其代謝調(diào)節(jié)機制又特點各異，于是依據(jù)產(chǎn)物生成速率與細胞生長速率之間的關(guān)系，將產(chǎn)物的形成與微生物細胞生長關(guān)系的動力學(xué)模型分為3類：Ⅰ生長偶聯(lián)型；Ⅱ部分生長偶聯(lián)型或稱混合型；Ⅲ非生長偶聯(lián)型[15，18]，常用Luedeking-Piret方程[19-20]描述產(chǎn)物形成與細胞生長的關(guān)系如下：

式中：X為菌體濃度，mg/L；P為青霉素?；该富睿琔/mL；

α為生長偶聯(lián)系數(shù)；β為非生偶聯(lián)聯(lián)系數(shù)。

α≠0、β=0表示第Ⅰ類發(fā)酵；α≠0、β≠0表示第Ⅱ類發(fā)酵；α＝0、β≠0表示第Ⅲ類發(fā)酵。從大腸桿菌產(chǎn)青霉素?；阜峙l(fā)酵試驗結(jié)果可以推斷該菌體的發(fā)酵過程屬于第Ⅱ類，即產(chǎn)物形成與細胞生長呈部分偶聯(lián)型。聯(lián)合公式（2）、（4），Luedeking-Piret方程可積分為代數(shù)方程：

式中：X為菌體濃度，mg/L；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h。P為青霉素?；该富?，U/mL；P0為初始青霉素?；该富?，U/mL；α為生長偶聯(lián)系數(shù)；β為非生偶聯(lián)聯(lián)系數(shù)。

由于P0=0，X0對產(chǎn)物的影響可以忽略不計，式（5）可簡化為：

式中：μm為菌體最大比生長速率，h-1；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；t為時間，h。P為青霉素?；该富睿琔/mL；P0為初始青霉素?；该富?，U/mL；α為生長偶聯(lián)系數(shù)；β為非生偶聯(lián)系數(shù)。

參照公式（6），采用Origin 8.0繪圖軟件對大腸桿菌產(chǎn)青霉素酰化酶發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，結(jié)果如圖3所示，得到青霉素酰化酶合成量（P）隨發(fā)酵時間變化的函數(shù)：

式中：P為青霉素?；该富睿琔/mL；t為時間，h。

其中α=-0.22052，β=0.05306，青霉素?；富畹膶嶒炛蹬c模型計算值的比較見圖3。由圖3觀察得出公式（7）較好的擬合了所得的實驗數(shù)據(jù)，R2=0.993 0，也驗證了該方程很好的描述出發(fā)酵過程中青霉素?；傅暮铣汕闆r，但受到發(fā)酵液中蛋白酶以及其他限制性因素的影響，青霉素?；该富盍υ诤铣珊笃诘脑鲩L受到了抑制。若及時補充底物，則可促進酶的繼續(xù)合成，工業(yè)生產(chǎn)上可參考這一規(guī)律。

圖3 青霉素?；富畹脑囼炛蹬c模型計算值的比較Fig.3 Comparison of experimental data with calculated data on penicillin acylase activity

2.2.3 基質(zhì)消耗動力學(xué)模型

大腸桿菌產(chǎn)青霉素?；赴l(fā)酵過程中，甘油的消耗一方面用于菌體生長，同時又用于其菌體細胞的維持和產(chǎn)物的合成及代謝，因此基質(zhì)消耗速度可以由與Luedeking-Piret相似的方程表示：

式中：S為甘油濃度，g/L；X為菌體濃度，mg/L；t為時間，h；YX/S為碳源用于菌體生長得率常數(shù)；γ為碳源用于產(chǎn)物積累得率常數(shù)。

結(jié)合方程式（2）、式（8）積分可得：

式中：S為甘油濃度，g/L；S0為初始甘油濃度，g/L；X為菌體濃度，mg/L；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h；YX/S為碳源用于菌體生長得率常數(shù)，λ=1/YX/S；γ為碳源用于產(chǎn)物積累得率常數(shù)。

按照公式（9）對發(fā)酵過程中甘油消耗的實驗值進行非線性擬合，結(jié)果如圖4所示，得到基質(zhì)消耗量隨發(fā)酵時間變化的方程：

式中：S為甘油濃度，g/L；t為時間，h。

其中S0=21.085 37g/L，λ=0.449 28，λ=-0.004 67，由圖4可以看出，式（10）能夠很好的擬合了所得的實驗數(shù)據(jù)，R2= 0.997 1，證明該模型能夠很好的描述青霉素酰化酶合成過程中基質(zhì)消耗情況。

圖4 基質(zhì)消耗的動力學(xué)模型與實驗數(shù)據(jù)的比較Fig.4 Comparison of kinetic model data with experimental data on substrate consumption

3 結(jié)論

根據(jù)重組大腸桿菌M3發(fā)酵產(chǎn)青霉素?；高^程中各個參數(shù)的變化，采用Logistic方程和Luedeking-piret方程模擬出發(fā)酵的動態(tài)過程，建立了重組大腸桿菌M3產(chǎn)青霉素?；傅陌l(fā)酵動力學(xué)方程，分別為：

（1）菌體生長動力學(xué)模型

（2）青霉素?；负铣蓜恿W(xué)模型

（3）基質(zhì)消耗動力學(xué)模型

經(jīng)過3個實驗值與模型值的比對，發(fā)現(xiàn)所建立的動力學(xué)模型很好的擬合了實驗數(shù)據(jù)，得出該菌株發(fā)酵動力學(xué)中菌體生長、青霉素?；负铣梢约盎|(zhì)消耗的相關(guān)系數(shù)分別為：0.995 5、0.993 0、0.997 1。綜上所述，3個模型的建立可以解釋重組大腸桿菌M3產(chǎn)青霉素?；傅陌l(fā)酵動力學(xué)規(guī)律，為工業(yè)生產(chǎn)提供了可行的參考依據(jù)。

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Fermentation kinetics of penicillin acylase produced by recombinantEscherichia coli

WEI Xiaoju,LI Jilie*,ZHU Xiaoyuan
(Ministry of Education Economic Forest Cultivation and Conservation of Education Ministry Key Laboratory,College of Life Science and Technology,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China)

The fermentation kinetics for penicillin acylase production by the recombinantEscherichia coliM3 was studied in this paper.Based on the Logistic and Luedeking-Piret equation,the kinetic models of recombinantE.coliM3 about microorganism growth,penicillin acylase formation,substrate consumption and model parameter were proposed.The result showed that the fermentation process of penicillin acylase produced by recombinantE.coliM3 could be well expressed by the model.

penicillin acylase;batch fermentation;fermentation kinetics model

TQ920.1

A

0254-5071（2014）03-0032-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.009

2014-01-25

國家林業(yè)局“948”項目（NO.2011-4-17）

韋曉菊（1987-），女，碩士研究生，研究方向微生物工程。

*通訊作者：黎繼烈（1959-），女，教授，博士，研究方向農(nóng)產(chǎn)品生物加工。

分批發(fā)酵過程中菌體生長、青霉素?；负铣?、基質(zhì)消耗的動力學(xué)模型及模型參數(shù)。結(jié)果表明，重組大腸桿菌M3產(chǎn)青霉素?；傅陌l(fā)酵動態(tài)過程能很好的被該模型所表達。